一種檢測塑化劑的時間分辨熒光免疫試劑盒的制備
【技術領域】
[0001]本發明屬于生物檢測領域，具體的說，涉及一種檢測塑化劑的時間分辨熒光免疫試劑盒的制備。
【背景技術】
[0002]塑化劑是一種增加材料的柔軟性或是材料液化的添加劑。鄰苯二甲酸酯類塑化劑被歸類為疑似環境荷爾蒙，其生物毒性主要屬雌激素與抗雄激素活性，會造成內分泌失調，損害生物體生殖機能，包括生殖率降低、流產、天生缺陷、異常的精子數、睪丸損害，還會引發惡性腫瘤、造成畸形兒，導致兒童性早熟。
[0003]鄰苯二甲酸二丁酯(Dibutyl phthalate, DBP)是一種常用的塑化劑,也用作膠粘劑和印刷油墨的添加劑，也可用作一種殺體外寄生蟲藥。它具有較強的生殖毒性，可引起男性生育能力下降，尤其對兒童的毒性更大。DBP主要存在于人造革、塑料制品、化妝品、香精及農藥中。
[0004]目前，檢測塑化劑的方法主要有高效液相色譜法HPLC、氣相色譜法GC等。其中，高效液相色譜法HPLC、氣相色譜法GC是定量的檢測方法，結果準確可靠，缺點是檢出限較高、儀器設備較為昂貴，以及復雜的樣本前處理方法，限制了該方法的廣泛應用。酶聯免疫吸附ELISA法是一種準確、可靠、快速、特異的檢測方法，適合于大批樣品的快速篩選，近年來已廣泛應用。
[0005]本發明旨在建立一種檢測塑化劑(DBP)的時間分辨熒光免疫(TR-FIA)試劑盒，由于其特異性強、靈敏度高、操作簡單、廉價，且特別適于大批量樣品的檢測等優點而越來越被人們所重視和采用。目前針對塑化劑檢測的時間熒光免疫分析法的專利和文獻報道較少。
【發明內容】
[0006]為解決以上技術問題，本發明的目的在于提供一種白酒中塑化劑(DBP)殘留的檢測時間分辨熒光免疫分析試劑盒。
[0007]本發明的目的之二在于提供一種快速簡便地檢測白酒中塑化劑(DBP)的時間分辨熒光免疫分析試劑盒的檢測方法，用于定量或定性地檢測白酒中塑化劑(DBP)殘留量。
[0008]本發明目的之一是這樣實現的:檢測塑化劑(DBP)的時間分辨熒光免疫分析試劑盒，其關鍵在于由多孔包被板、緩沖液、塑化劑標準品溶液、抗塑化劑的抗體凍干品、銪標記的兔抗鼠抗體、洗滌液和增強液體所組成。
[0009]本發明目的之二是這樣實現的:檢測塑化劑(DBP)的時間分辨熒光免疫分析試劑盒的檢測方法，包括免疫原、包被原和單克隆抗體的制備以及樣品前處理及檢測，其關鍵在于:
(I)免疫原的制備:將半抗原塑化劑(DBP)與牛血清白蛋白(BSA)偶聯，得到免疫原(DBP-BSA)； (2)包被原的制備:將半抗原塑化劑與卵血清白蛋白(OVA)偶聯，得到包被原(DBP-OVA)；
(3)單克隆抗體的制備:
a.用步驟(I)的免疫原(DBP-BSA)免疫小鼠，通過雜交瘤技術，得到分泌抗塑化劑的單克隆抗體的雜交瘤細胞株；
b.以體內誘生腹水法大量制備抗體，使用ProteinG柱進行純化，獲得抗塑化劑的單克隆抗體IgG ；
c.用步驟(2)的包被原包被96孔包被板；
(4)樣品的前處理及檢測:
取5 mL樣品于干凈的玻璃試管中，加入2 mL色譜純的正己烷，蓋上蓋后振蕩3 min，然后靜置，待分層后取上層清液I mL，于干凈的玻璃器皿室溫氮氣吹干，吹干后用ImL 35%的甲醇復溶后待測；
配制35%的甲醇溶液:取35 mL甲醇加入65ml去離子水中混勻；
取包被有包被原(DBP-OVA)的多孔包被板，加入50 μ?的標準品/樣品到各自的微孔中，加50 μ?以緩沖液稀釋的抗塑化劑抗體，25°C?37°C振蕩0.5~1小時，洗滌液洗3次，力口以緩沖液稀釋的100 μ? Eu3+ -兔抗鼠抗體，25°C?37°C振蕩0.5~1小時，洗滌液洗6次，力口200 PL增強液振蕩5分鐘后測量熒光強度cps，根據標準曲線計算樣品中的塑化劑含量。
[0010]上述的固相載體是多孔包被板，采用96孔的多孔包被板作為固相載體。
[0011]本發明主要采用時間分辨熒光免疫分析方法來檢測塑化劑。采用時間分辨熒光免疫分析法的技術主要有兩個方面:第一，特異性單克隆抗體制備，用偶聯的免疫原免疫小鼠，通過雜交瘤技術，得到分泌抗塑化劑的單克隆抗體的雜交瘤細胞株；以體內誘生腹水法大量制備抗體，使用Protein G柱進行純化，獲得抗塑化劑的單克隆抗體IgG。第二，Eu3+標記抗體的制備。
[0012]本發明測定方法:測定的基礎是標記免疫反應。包被有DBP-OVA的多孔包被板，加入測試樣品到各自的微孔中，再加入抗塑化劑抗體，振蕩反應，游離的塑化劑與微孔板上的DBP-OVA競爭抗塑化劑抗體，洗滌液洗滌，沒有連接的塑化劑抗體在洗滌步驟中被除去。加入Eu3+-兔抗鼠抗體，進行標記免疫反應，再用洗滌液洗滌，反應后沒有連接的Eu3+-兔抗鼠抗體在洗滌步驟中被除去。加增強液振蕩后，在紫外燈的激發下發射很強的熒光，用時間分辨熒光儀測定其熒光強度cps，熒光強度與樣品中的濃度成反比，對照標準曲線即可確定樣品中塑化劑的量。
[0013]本發明檢測方法不需要昂貴的儀器，樣品前處理簡單、能現場操作檢測，應用廣泛，該方法靈敏、準確、快速，操作簡便、特異性強，適用于大批樣品的快速檢測。
【附圖說明】
[0014]圖1為本發明的塑化劑標準品與抗體的TR-FIA標準抑制曲線圖。
【具體實施方式】
實施例
[0015]1、免疫原與包被原制備
本發明免疫原(DBP-BSA)的合成:準確稱取塑化劑324mg溶解在2mL N，N- 二甲基甲酰胺中，攪拌下逐滴加入Y-氨基丁酸溶液，攪拌反應3小時，調節反應液pH 10左右。離心除掉沉淀物。將上述反應逐滴加入BSA溶液中(320mg BSA溶解于5mL生理鹽水)，再加入N-羥基琥珀酰亞胺(NHS) 23mg, N, N- 二環己基碳二亞胺(DCC) 45.4mg，4°C反應過夜，離心除去沉淀，取上清液用磷酸緩沖液(PBS)透析3天，每6小時更換透析液，將所得產物低壓凍干，于_20°C保存備用。
[0016]包被原(DBP-OVA)的合成:在上述反應中，將BSA換成OVA后，得到反應偶聯物DBP-0VA,該偶聯物作為TR-FIA檢測時作為包被原使用。
[0017]2、單克隆抗體制備
2.1動物免疫
用步驟I制備的免疫原分別免疫6周齡雌性Balb/c小鼠，每只小鼠的免疫劑量為lOOPg/0.2mL。首次免疫，用無菌0.01mol/L pH7.4 PBS溶解免疫原(DBP-BSA)，再與等量弗氏完全佐劑混合，完全乳化，勁背部皮下分2?3點注射；加強免疫，用0.01mol/L pH7.4PBS溶解免疫原與等量弗氏完全佐劑混合，充分乳化，小鼠腹腔注射。每次間隔14?21天，第3次免疫后7?10天開始對免疫小鼠尾靜脈采血，收集血清,用ELISA檢測小鼠血清效價。末次免疫后間隔4周以上，在細胞融合前3?4天，腹腔注射DBP-BSA抗原lOOPg/0.2mL/只，注射后每天注意觀察，保證融合前小鼠狀態良好。
[0018]2.2單克隆抗體制備
分離免疫小鼠的脾細胞，并進行勻漿制備免疫脾細胞。取I只免疫的Balb/c小鼠，從眼眶放血分離血清作為陰性血清，處死。小鼠用75%酒精浸泡5min，進行整體消毒。將小鼠四肢固定，然后用鑷子夾住小鼠下腹部皮膚，剪開一小口，再用鑷子撕開皮膚，露出腹膜，換一套鑷子和剪刀，在腹部中央腹膜上用剪刀剪開一小口。換一套鑷子和剪刀，用剪刀剪開腹膜，露出脾臟，再換一套器械用鑷子夾住脾臟，用剪刀將脾臟外膜剪破，然后放入事先滅菌的勻漿器中。加適量基礎培養基(RPM1-1640)于勻漿器中，進行研磨，擠壓出脾細胞，取出勻漿器的勻漿棒，再補加適量基礎培養基(RPM1-1640)，靜置2min，將上層細胞液吸取后，放入腹腔巨噬細胞離心管中，重復上述操作I次。1200r/min離心lOmin，除去上清。將18個免疫脾細胞與I?2X107個SP2/0骨髓瘤細胞按照1:10或1:5的比例加入離心管中，進行混勻，然后于1500r/min水平離心lOmin，棄去上清。將離心管倒扣在滅菌的吸水紙上，把管中液體吸干。用手指或桌面輕輕敲擊管底，讓沉淀的細胞松動，再把離心管置于37°C水浴鍋中。在Imin內緩慢將50% PEG 0.8mL滴入離心管中，邊加邊輕輕用吸管尖攪拌沉淀細胞。再繼續攪拌30s后，靜置lmin，然后慢慢加入事先進行37°C預溫的40mL基礎培養基(RPM1-1640)ο加基礎培養基方法為:第Imin內逐滴滴入ImL,第2min內逐滴滴入2mL，第3min內逐滴滴入3mL,第4min內逐滴滴入4mL,在每次加培養基時需緩慢加入,并輕輕地攪拌培養基，最后將剩余的RPM1-1640培養基慢慢加入。1000r/min離心5min，除去上清。然后用HAT培養基懸浮混合的細胞，再加入飼養脾細胞。根據需要補加適量的HAT培養基，混合均勻，再將含有飼養細胞的細胞融合液滴加到96孔細胞培養板上，滴加量約為150?/孔。將培養板置于37 °C、5% CO2飽和濕度培養箱中，進行培養。用建立的間接ELISA篩選陽性細胞克隆。選擇強陽性集落生長的孔，用有限稀釋法進行克隆。并對其他陽性孔，進行24孔擴大培養，用間接ELISA和間接競爭ELISA對擴大培養孔的上清液進行檢測，對間接ELISA和間接競爭ELISA均為陽性孔的細胞進行液氮冷凍保存。通過融合檢測，并進行3次亞克隆后獲得雜交瘤細胞株。雜交瘤細胞株經過多次傳代、凍存、復蘇，雜交瘤細胞分泌抗體穩定。進行雜交瘤細胞染色體的計數，將每株雜交瘤細胞隨機選擇20個細胞，進行細胞染色體條數的計數，再計算細胞染色體條數的平均值。小鼠脾細胞染色體數為40條，SP2/0細胞的染色體數目平均數為62~68條，而本試驗獲得的20株雜交瘤細胞染色體數目都在92~103條之間，平均為96.8條。本雜交瘤細胞染色體數目高于兩親本細胞的染色體數目，說明是兩種細胞的雜交產物。取細胞株細胞分泌的培養上清液，進行1:10稀釋后，用夾心ELISA方法測定抗體亞型，