Her2結合劑的應用

Her2結合劑的應用
【專利說明】HER2結合劑的應用 發明領域
[0001]本發明涉及使用與放射性核素綴合的分離多肽的方法;其中所述分離多肽與HER2 或其變體特異性地結合。
[0002] 背景 人表皮生長因子受體2 (HER2,也稱為HER2/neu或ErbB-2)是一種屬于表皮生長因子受 體家族的185 kDa的跨膜受體(1KHER2基因擴增和蛋白過度表達在許多類型的癌癥的發病 機理和進展中起著關鍵作用。HER2在25-30%的乳腺癌、15-35%的胃癌和7-38%的卵巢癌中過 度表達并與差的生存相關(2-5)。因而所述蛋白作為癌癥療法的重要的預測生物標記物和 靶標近年來已經出現(6)。與其家族的其它成員同源-或異源二聚化促進細胞內酪氨酸激酶 結構域的激活并引發通過MAPK和Akt信號傳導途徑介導的細胞存活和增殖(7、8)。
[0003] 臨床中可利用的HER2-靶向療法包括抗體，例如曲妥珠單抗（Herceptin， Genentech)和帕妥珠單抗(Per jeta, Genentech)，其防止受體二聚化;抗體-藥物綴合物， 例如T-DM1 (Kadcyla, Genentech);或祀向酪氨酸-激酶結構域的小分子抑制劑(如拉帕替 尼，Tyverb, GlaxoSmithKline; -種雙重HER2和EGFR抑制劑）。細胞外結構域的蛋白水解脫 落或在有限的情況下可供選擇的剪接可生成一種截短的、信號傳導殘留P95HER2結構域，其 提出抵抗抗-HER2療法的最主要機制之一 (9)。雖然曲妥珠單抗形成抗-HER2靶向療法的支 柱，但它不逆轉HER2蛋白表達。因此在該背景下，分子伴侶HSP90的抑制劑(其引起HER2蛋白 酶體降解）目前正在研究中。一種這樣的抑制劑，NVP-AUY922 (Novartis)正處于II期臨床 試驗。
[0004] HER2狀態的準確檢測對患者的分層，以鑒別很可能從這樣的靶向療法(特別是曲 妥珠單抗或帕妥珠單抗)獲益的個體是至關重要的。然而，這可能是復雜的，因為HER2表達 可從原發性疾病至繼發性疾病(伴有往往不適合活檢的局部和遠端復發）的整個進展過程 變化（10)。而且，最近的研究已強調作為不正確評估的潛在來源的空間異質性（11)。絕大多 數的FDA-批準的診斷基于免疫組織化學（IHC)和熒光原位雜交(FISHhIHC測定HER2蛋白在 甲醛固定石蠟包埋的（FFPE)腫瘤活檢材料中的表達，而FISH檢測HER2基因擴增，其被認為 是合理的替代物，因為HER2過度表達一般是由拷貝數變化引起的（12)。通過檢測可溶性細 胞外結構域的基于血清的替代物的使用也在研究中（13)。
[0005] 使用放射性標記的親和體(Affibody)分子(其為非-免疫球蛋白-衍生的親和力蛋 白）的腫瘤標記物-靶向分子成像，可能提供對HER2分子診斷的一種精確和非侵入性的替 代。親和體分子被工程改造為衍生自葡萄球菌蛋白A的三螺旋束Z蛋白（14)。它們的特征在 于納摩爾至皮摩爾的結合親和力，與抗體或抗體片段(~20-150 kDa)比較的~6.5 kDa的小 尺寸，和短的血漿滯留時間，因此允許快速的和均勻的組織分布。因此，高對比度的圖像可 在施用第一小時或兩小時內獲得（15、16)。而且，這些分子與全IgG抗體比較非常適合于用 短壽命放射性同位素進行放射性標記。
[0006] 癌癥患者的HER2狀態的精確評價仍然是一個臨床挑戰，高達20%的患者有可能退 出治療或暴露于不必要的毒性。非侵入性成像被廣泛認為是當前方法的一種可行的備選方 案，特別是在不適合活檢的局部和遠端復發的情況下，但是由正電子發射斷層掃描取得的 臨床成功迄今已受到在肝和腎中延長的示蹤劑滯留的阻礙，其阻礙對近端轉移的檢測。
[0007] 發明概述 現在已發現，HER2-靶向親和體[18F]GE-226提供一個可行的策略，以確定HER2差異表 達，而不管譜系或在注射后1小時內用曲妥珠單抗預處理。本文提供使用全長對比P95HER2 轉染的細胞和siRNA HER2作為對照，或HSP90抑制劑處理以降解HER2，洞察親和體與HER2的 相互作用的動力學特征。
[0008] 如下文所述，本發明提供一種使用HER2結合劑以監測對HSP90抑制的反應的方法。 [0009]本發明提供一種監測對HSP90抑制的反應的方法，其包括以下步驟： (a) 給予受試者與18F綴合的分離多肽，其中所述分離多肽特異性地結合HER2或其變 體;和 (b) 使所述受試者成像;和 (c) 監測所述成像劑組成的吸收以測量HSP90抑制。本發明還涉及所述多肽作為成像 劑的用途。
[0010]發明詳述 分離多肽可以是特異性地結合用適合于診斷成像的放射性同位素綴合或標記的HER2 或其變體的任何多肽。雖然不限于此，但合適的分離多肽及其放射性標記的衍生物和制備 它們的方法的實例可發現于W02012/096760、W02012/087908和W02012/087912中，其各自通 過引用以其全文結合到本文中。優選地，分離多肽包含SEQ. ID No. 1、SEQ. ID. No 2或其 保守變體，如在W02012/096760、W02012/087908和W02012/087912中所述，其各自通過引用 以其全文結合到本文中。更優選地，分離多肽是HER2-結合的18F-放射性標記的Affibody ? 分子ZHER2:2891 [SEQ ID NO 2]，本文稱為[18F]GE-226[SEQ ID NO 2]并在所附的序列表 中描述。 toon] 實施例： 實驗設計：內在的細胞[18F]GE-226[SEQ ID N0 2]吸收和腫瘤特異性示蹤劑結合在用 或不用藥物處理的細胞和異種移植物中評價。通過比較熒光標記的類似物的腫瘤定位與 DAK0 HercepTest?，進一步測定特異性。
[0012] 結果：[18F]GE-226[SEQ ID N0 2]吸收在10個HER2陽性細胞系中比陰性細胞系（體 外獨立于譜系）高11-67倍。HER2陽性異種移植物中的吸收是快速的，凈不可逆結合動力學 使得有可能在 1 小時內區別HER2陰性(MCF7和MCF7-p95HER2: NUV6q (%ID/mL) 6.1 ± 0.7; Ki (mL/cm3/min) 0.0069 ± 0.0014)與HER2陽性腫瘤（NUV6〇和Ki: MCF7-HER2, 10.9 土 1.5和0.015 ± 0.0035;MDA-MB-361, 18.2 ± 3.4和0.025 ± 0.0052;SK0V-3, 18.7 土 2.4和0.036 ± 0.0065)。腫瘤吸收與由ELISA測定的HER2表達相關(r2 = 0.78)，并在細胞 水平與HER2表達共定位。示蹤劑吸收在保持與差異表位結合方面不受用曲妥珠單抗短期或 連續處理的影響，但反映了通過短期NVP-AUY922處理，在SK0V-3異種移植物中的HER2降解 (NUV 6q: 13.5 ± 2.1對比9.0 ± 0.9 % ID/mL，分別對于媒介或藥物）。
[0013] 結論：[18F]GE-226[SEQ ID N0 2]高特異性地結合HER2 (獨立于細胞譜系）。示蹤 劑具有用于HER2檢測(而不管先前的曲妥珠單抗處理），和監測對HSP90抑制的反應的用途。 [00M] 結果 對HER2的內在的親和力(KD = 76 pM)導致[18F]GE-226吸收在10個HER2陽性細胞系中 比陰性細胞系(體外獨立于譜系）高11-67倍。吸收與HER2蛋白表達相關，但獨立于其它靶標 像EGFR的存在。用[19F]GE-226[SEQIDN0 2]和HER2siRNA處理阻斷減少吸收分別達96.8 ± 2.6%和81.7 ± 9.2%。在HER2陽性異種移植物中的吸收是快速的，穩定狀態凈不可逆結 合動力學使得有可能在1小時內區別HER2陰性(MCF7和MCF7-p95HER2: NUV6q (%ID/mL) 6.1 ± 0.7;Ki (mL/cm3/min) 0.0069 ± 0.0014)與HER2陽性腫瘤（NUV6〇和Ki: MCF7-HER2, 10.9 ± 1.5和0.015 ± 0.0035;MDA-MB-361, 18.2 ± 3.4和0.025 ± 0.0052;SK0V-3, 18.7 ± 2.4和0.036 ± 0.0065)。腫瘤吸收與由ELISA測定的HER2表達相關(r2 2 0.74， 當變量為NUV6Q或Ki時）。通過比較熒光標記的示蹤劑類似物的腫瘤定位與DAKO HercepTest?，進一步測定特異性。親和體腫瘤信號與HER2表達在細胞水平(獨立于空間異 質性)上共定位。示蹤劑結合在保持與差異表位結合方面不受SKOV-3異種移植物短期或連 續暴露于曲妥珠單抗(50 mg/kg腹膜內推注，接著兩個劑量25 mg/kg (腹膜內），經總共7 天）的影響。在SKOV-3異種移植物中的3個日劑量50 mg/kg NVP-AUY922后，蛋白伴侶 HSP90--其中HER2是客戶（c 1 i ent)蛋白--被NVP-AUY9 22抑制在體外和體內引起劑量依 賴性冊1?2降解并從而減少31(0￥-3細胞中的示蹤劑吸收以1]〇)-6() :618.4±90.1對比446.7 ± 42.8 % ID/mI>min，分別對于媒介和藥物;P = 0.043)。
[0015]材料和方法 化學和放射化學
[18F]GE-226[SEQ ID NO 2]使用對在FASTlab上自動制備進行優化的氟苯甲醛(FBA) 策略來標記。簡言之，放射化學使用馬來酰亞胺-氨基氧基乙酰基（male imide-aminooxyacetyl)親和體分子前體，其結合于[18F]氟苯甲醛合成子，接著固相提取(SPE)產 物純化。典型的非衰減校正的最終合成產率是25%和放射化學純度是95%。
[0016]表面等離子體共振 為了鑒定[19F]GE-226[SEQ ID N0 2]對HER2蛋白的親和力，進行表面等離子體共振研 究。人、恒河猴和大鼠 HER2-ECD-Fc (SINO Biological，北京，中國，Cat. Nr: 10004-H02H、 90020-K02H和80079-R02H)，以及人HER2-ECD-Fc-6XHis (R&D Systems, Minneapolis, MN， Cat. Nr: 1129-ER)和p95HER2 ECD-Fc-6XHis (Syngene， Cambridge, United Kingdom)用50 mM乙酸鈉 pH 4.5 (Biacore (GE Healthcare, Buckinghamshire, UK)偶聯 緩沖劑)稀釋至最終濃度10 yg/mL。至Biacore傳感芯片CM5 (Cat. Nr: BR-1005-30)的抗 原偶聯依據來自儀器手冊(Syngene)中的胺偶聯方案進行。HBS-EP緩沖液（10 mM HEPES pH 7.4,150 mM NaCl, 3 mM EDTA和0.005%表面活性劑P20;GE Healthcare, Little Chalfont, United Kingdom, Cat. Nr: BR-1006-69)被用作運行緩沖液并作為物質的溶 劑。親和力研究使用Biacore T100 (GE Healthcare)進行。[19F]GE-226在HBS-EP緩沖液中 稀釋至50 ηΜ、25 ηΜ、12·5 ηΜ、6·25 ηΜ、3·125 ηΜ、1·56 ηΜ、0·78 ηΜ、0·39 ηΜ、0·195 nM、 0.097 ηΜ、0.049 ηΜ和0 ηΜ。第一芯片的流動池包含空白、人HER2-ECD-Fc-6XHis、p95HER2-ECD-Fc-6XHis批I和p95HER2-ECD-Fc-6XHis批II。第二芯片上的流動池包含空白、人HER2-ECD-Fc、恒河猴HER2-ECD-Fc和大鼠 HER2 ECD-Fc。蛋白的固定用蛋白-A (Sigma-Aldrich， St. Louis, M0, Cat. Nr: P6031)和抗-人IgG抗體（Perkin Elmer, Waltham, MA, Cat. Nr: NEF803001EA)驗證。將[19F]GE-226[SEQ ID NO 2]以隨機的次序，以50 yL/min流速一 式兩份栗到池上60秒鐘，接著經120秒的HBS-EP以監測解離。之后接著用50 mM氫氧化鈉，以 30 yL/min流速經30秒鐘使芯片再生，接著運行HBS-EP 60秒鐘以穩定表面。使用 Langmuirl: 1結合模型和締合和解離相的同時計算進行動力學計算。
[0017] 細胞和處理 MCF7-載體（piRES)、MCF7-p95HER2和MCF7-HER2細胞由 Jos6 Baselga' s實驗室饋贈
[17] JCF7克隆、MDA-MB-231 (ATCC，Manassas, VA)、MDA-MB-361 (Sigma-Aldrich)、 SKBR-3 (ATCC)和SKOV-3 (Sigma-Aldrich)細胞在DMEM中維持。AGS (Sigma-Aldrich)、 HGC-27 (Sigma-Aldrich)、NCI-N87 (ATCC)和OE-33 (ATCC)細胞在RPMI (Sigma-Aldrich) 中維持。A431細胞(Sigma-Aldrich)在MEM Eagle培養基(Sigma-Aldrich)中維持。生長培養 基補充有10% FCS (Lonza, Basel, Switzerland)、谷氨酰胺和抗生素（二者得自 Invitrogen, Paisley, United Kingdom) <^431細胞另外補充有1%非-必需氨基酸。所有細 胞于37°C，在含有5% C02的潮濕氣氛中培養。
[0018] 對于siRNA-介導的HER2敲除，依據生產商的指示，通過采用Lipofectamine RNAiMAX (Invitrogen)的逆濕轉染，用25 nM混雜對照（SCR;Dharmacon, Lafayette, C0, ΟΝ-TARGETplus非靶向合集，Cat. Nr: D-001810-10-05)或HER2-靶向siRNA (Invitrogen ERBB2 Silencer? Select Validated siRNA;Cat. Nr: 4457298)轉染SK0V-3細胞。在吸 收實驗前48小時，將3 x 105個細胞接種到12-孔板。靶標敲除經蛋白質印跡法在平行轉染 的細胞上驗證。
[0019] 對于所有的對藥物處理的反應的吸收研究，在吸收實驗前48小時，將2.5 X 105 SK0V-3細胞接種到完全培養基中。在加入放射示蹤劑之前細胞與指定劑量的NVP-AUY922 (LC Laboratories, Woburn, ΜΑ)一起培養24 h和與 10 yg/mL曲妥珠單抗（Roche, Basel， Switzerland)一起培養 1 或24 h〇