一種晚期結直腸癌患者外周血循環腫瘤細胞egfr的檢測方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種檢測EGFR的新方法，尤其是檢測晚期結直腸癌患者外周血循環腫 瘤細胞EGFR的方法。
【背景技術】
[0002] 晚期結直腸癌患者，靶向聯合化療可以明顯延長晚期結直腸癌無病無進展生存期 和總生存期。晚期結直腸癌患者臨床目前應用的靶向藥物中。西妥西單抗是一種靶向EGFR 的IgGl單克隆抗體，已在臨床上應用，并取得一定療效。
[0003] EGFR是配體激活受體酪氨酸激酶erB-B家族成員之一，其參與腸黏膜的生長、增殖 和再生，并在結直腸癌的發展過程中起著至關重要的作用。在50%-85%的結直腸癌標本中 EGFR呈陽性表達，并且其表達程度與臨床分期、有無淋巴結轉移、無病生存期、總生存期、5 年復發率等密切相關。
[0004] 人EGF受體（human epidermal growth factor receptor，HER)家族由4個成員組 成，分別稱為HER1 (EGF erbB)、HER2 (Neu/erbB2)、HER3 (erbB3)和HER4 (erbB4)，均屬于I 型 酪氨酸激酶受體基因家族。其蛋白質結構可以分為3個區域:細胞表面的配體結合區、跨膜 區和細胞內的酪氨酸激酶區。EGFR在缺乏特異性配體時以單體形式存在，但與配體結合后 發生聚合。二聚體形式改變了蛋白質構象，導致酪氨酸激酶活化和受體自身磷酸化，后者通 過JAK-STAT和PI 3K-Akt等轉導途徑將信號傳遞到細胞核內，從而促進細胞增殖，血管生成、 轉移和抑制細胞凋亡。EGFR與惡性細胞的生長有關，激活EGFR可以促進腫瘤的生長和進展。
[0005] 目前常用的EGFR檢測方法為免疫組織化學方法，通過檢測結直腸癌組織標本中的 EGFR蛋白表達情況判定EGFR狀態。免疫組化法是以腫瘤組織為檢測對象，而對于晚期無法 獲取組織標本的結直腸癌患者，EGFR表達狀態評估變得困難。
【發明內容】
[0006] 循環腫瘤細胞(Circulating tumor cell，CTC)是從實體腫瘤脫落進入外周血液 循環的腫瘤細胞，自1989年被發現以來，目前已有多種方法用于外周血循環腫瘤細胞的檢 測。近期研究表明，其檢測對于評估腫瘤患者尤其是晚期腫瘤患者的預后以及選擇合適的 個體化治療具有重要的臨床意義。因 CTC檢測具有微創、實時檢測等特點，被稱為腫瘤的"液 態活檢"。
[0007] 研究表明，外周血循環腫瘤細胞與原發瘤細胞活性存在一定的一致性。目前對于 晚期無法獲得臨床標本結直腸癌患者的治療仍采用經驗用藥，為了避免無法獲取組織標本 的晚期結直腸癌患者無法檢測EGFR表達，進而不能評估患者EGFR狀態的不足，本發明提供 了一種晚期結直腸癌患者外周血循環腫瘤細胞EGFR的檢測方法:利用膜過濾裝置分離獲得 無法獲取組織標本的晚期結直腸癌患者外周血中的CTC，運用細胞蠟塊技術制作薄層切片， 進而檢測無法獲取組織標本的晚期結直腸癌患者外周血CTC的EGFR表達情況。
[0008] 本發明采用的技術方案如下：
[0009] -、利用膜過濾裝置分離獲得無法獲取組織標本的晚期結直腸癌患者外周血中的 CTC：
[0010] 1、采集晚期結直腸癌患者外周血:肘正中靜脈血5ml;
[0011] 2、外周血樣預處理：將采集的外周血樣10倍稀釋，稀釋液成分：lmmol/lEDTA+ 0.1%BSA，稀釋后加多聚甲醛固定外周血樣10分鐘，固定終濃度為0.25%;
[0012] 3、利用膜過濾分離腫瘤細胞裝置過濾外周血樣，分離獲得外周血循環腫瘤細胞： 將預處理的外周血樣加入到膜過濾分離腫瘤細胞裝置的血樣容器中，使其依靠重力自然過 濾；
[0013] 4、過濾結束后，從膜過濾分離腫瘤細胞裝置中取下濾器，將循環腫瘤細胞染色液A 液0.5ml加入到濾器中，染色3min，PBS緩沖液沖洗干凈;濾液過濾完全后加入B液，lml，染色 2min，純水lml，沖洗2次，取下濾膜，放置在載玻片上，干燥后在顯微鏡下觀察，確定是否存 在 CTC。
[0014] 二、運用細胞蠟塊技術制作薄層切片：
[0015] 1、脫色:將帶有CTC的濾膜從載玻片上取下，置于脫色液中浸泡4-6小時，脫去CTC 染色液，所述脫色液為:95 %酒精與100 %二甲苯按容積比1:1混勻。
[0016] 2、包裹:浸泡結束后取出濾膜，用顯微鏡擦鏡紙或濾紙包裹；
[0017] 3、固定:將包裹物置于10%中性福爾馬林中，固定4-6h;
[0018] 4、浸蠟包埋：固定結束后取出包裹物，脫水后置于石蠟包埋盒中，浸蠟包埋制作細 胞石蠟塊；
[0019] 5、薄層切片:用切片機將細胞石蠟塊連續切片，制成厚度為4μπι的薄層切片。
[0020] 三、檢測晚期結直腸癌患者外周血CTC的EGFR表達情況：
[0021] 1、將CTC蠟塊薄層切片在染色缸中按以下步驟進行脫蠟和水化:二甲苯溶液浸泡3 次，每次10分鐘;無水乙醇溶液浸泡3次，每次5分鐘;95 %乙醇溶液浸泡5分鐘;85 %乙醇溶 液浸泡5分鐘；75 %乙醇溶液浸泡5分鐘；蒸餾水浸泡2次，每次3分鐘;ΡΗ = 7.4的PBS浸泡3 次，每次3分鐘。
[0022] 2、采用檸檬酸緩沖液高溫高壓抗原修復法對組織抗原進行修復:取ρΗ = 6.0檸檬 酸鹽緩沖液800_1500ml于壓力鍋中，大火加熱直至沸騰，將脫蠟水化后的組織切片置于耐 高溫不銹鋼切片架上，放入已沸騰的緩沖液中，鍋蓋繼續加熱至噴汽開始計時，噴汽1-2分 鐘后，壓力鍋離開熱源，冷卻至室溫，取出玻片，先用蒸餾水沖洗兩次，之后用pH = 7.2-7.4 的PBS沖洗兩次，每次各3分鐘；
[0023] 3、3%H2〇2去離子水孵育5分鐘，以阻斷內源性過氧化物酶，PBS沖洗3次，每次3分 鐘；
[0024] 4、滴加 EGFR-抗，室溫或37 °C孵育1-2小時或4°C過夜，PBS沖洗3次，每次5分鐘；
[0025] 5、滴加通用型生物素化二抗，室溫或37 °C孵育60分鐘，PBS沖洗3次，每次2分鐘；
[0026] 6、應用DAB溶液顯色：甩去roS液，每張切片加2滴或100μΙ新鮮配制的DAB溶液，顯 微鏡下觀察5-10分鐘；
[0027] 7、蒸餾水沖洗、復染、脫水、透明封片:蒸餾水沖洗2次，每次3分鐘;蘇木素復染1分 鐘;0.1 %鹽酸酒精分化;0.1 %氨水溶液返藍;50 %、70 %、85 %、95 %、無水乙醇脫水干燥； 二甲苯透明，中性樹脂膠封片；
[0028] 8、細胞病理學專家閱片，根據細胞著色程度判定EGFR表達情況。
[0029] 步驟中所述的膜過濾分離腫瘤細胞裝置，包括濾器、血樣容器、廢液缸和鐵架臺， 所述鐵架臺設有底座、立架和支架，所述血樣容器通過支架設置于鐵架臺上部，血樣容器的 下方為濾器，濾器通過輸液器聯通至廢液缸，廢液缸設置于底座上。
[0030] 所述濾器包括濾器上口、濾膜、載濾膜平臺和濾器下口，濾膜置于載濾膜平臺上； 濾器上口接血樣容器，濾器下口通過輸液器接廢液缸。
[0031 ]所述濾膜為疏水材料制成，其上均勻布滿口徑為10微米的濾孔。
[0032] 本發明的有益效果是:通過該技術方法，不用結直腸癌組織即可檢測到無法獲取 組織標本的晚期結直腸癌患者EGFR表達情況。該技術屬于微創，并能夠實時檢測。
【附圖說明】
[0033] 圖1為本發明的膜過濾裝置結構示意圖；
[0034] 圖2為本發明膜過濾裝置的濾器的結構示意剖視圖；
[0035] 圖3為本發明膜過濾裝置的濾器濾膜的結構示意圖；
[0036] 圖4為晚期結直腸癌患者外周血分離獲取的循環腫瘤細胞影像圖；
[0037] 圖5為晚期結直腸癌患者外周血循環腫瘤細胞EGFR免疫組化染色圖像。
[0038]圖中：1鐵架臺、2血樣容器、3濾器、4輸液器、5廢液缸、6濾器上口、7濾膜、8載濾膜 平臺、9濾器下口、10濾孔、11底座、12立架、13支架。
【具體實施方式】
[0039] 下面結合附圖和實施例對本發明闡述如下。
[0040] 運用此技術方法分離獲取并鑒定8例晚期結直腸癌患者（同時檢測8例正常人樣本 做陰性對照)外周血循環腫瘤細胞的實施例。
[0041] -、利用膜過濾裝置分離獲得無法獲取組織標本的晚期結直腸癌患者外周血中的 CTC：
[0042] 采集各樣本外周血5ml，用45ml稀釋液（成分：lmmol/l EDTA+0.1%BSA)稀釋外周 血，然后加入3ml的4%多聚甲醛固定稀釋后的血樣10分鐘。
[0043] 在固定的間期，組裝膜過濾裝置：如附圖1、圖2、圖3所示，該過濾裝置由濾器3、濾 膜7、血樣容器2、廢液缸5、鐵架臺1構成。用lOmlPBS潤濕濾器3,然后將固定好的外周血樣加 入到膜過濾裝置的血樣容器2中，使其依靠重力自然過濾，CTC被截留在濾膜7上。
[0044] 腫瘤細胞直徑一般大于15微米，而血細胞(包括紅細胞、白細胞)直徑一般小于10 微米，因此當含有CTC的外周血經過濾后，血細胞因直徑小于濾孔能夠被濾過，而CTC因直徑 大于濾孔被截留在濾膜上。
[0045]過濾結束后，從過濾裝置中取下濾器3，打開并移走濾器上口 6，將循環腫瘤細胞染 色液A液0.5ml加入到濾器中，染色3min，PBS緩沖液沖