一種豬瘟病毒抗原及其豬瘟病毒膠體金檢測試紙條的制備
【專利說明】
[0001]
技術領域
[0002] 本發明涉及生物工程領域，更具體的說，是涉及一種豬瘟病毒E2抗原及其豬瘟病 毒膠體金檢測試紙條的制備。
【背景技術】
[0003] 豬瘟是一種急性、熱性、高度接觸性的傳染病，主要癥狀是高溫、微血管變性而引 起全身出血、壞死、梗塞，其高度的發病率和死亡率給世界各國的養豬業造成了巨大的經濟 損失。我國也是豬瘟流行較嚴重的國家，每年因豬瘟死亡的豬占飼養總數的3°Ρ5%，造成了 巨大的經濟損失。由于它造成的經濟損失慘重，所以獸醫工作者一直在致力于豬瘟防制的 研究。因此長期以來，豬瘟一直是疫病研究中的重點和熱點。
[0004] 自80年代以后，隨著單克隆抗體和現代生物學技術的日益成熟和廣泛應用，人們 相繼研制了多種豬瘟病毒（CSFV)單抗，鑒定了 CSFV的中和抗原表位，尤其是測定了 CSFV 不同毒株的基因組全序列，從而有可能在分子水平上闡明CSFV本身的一些生物學特性以 及豬瘟發生的分子機制。隨著現代生物技術的發展，雖然豬瘟在其病原特性的分子生物學 研究等方面已取得了很大進展，但仍有許多問題亟待解決。
[0005] 在我國，由于C-株疫苗的長期使用，有效控制了豬瘟的急性發作和大流行。近年 來豬瘟的發生又呈上升趨勢，表現更加復雜，既有區域性大流行，又有零星散發；既有高死 亡率的急性癥狀，又有持續感染的溫和性癥狀。許多豬場的免疫豬群頻繁發病，甚至將疫苗 劑量加大數倍或數十倍，疫情依然不能控制，有些豬還因注射疫苗而引發豬瘟造成死亡，因 此根除豬瘟是一項艱巨而長期的工作，對流行毒株的致病性和核酸序列進行分析研究，了 解豬瘟病毒疫苗毒株與流行毒株之間的差異以及流行毒株的變異情況和致病特點，對于防 制豬瘟是十分必要的。
[0006] 隨著基因組學的不斷發展，CSFV基因組結構及其編碼的蛋白已被人們進一步認識 和了解。在病毒基因組所編碼的蛋白中，E2是3種囊膜糖蛋白中最重要的保護性抗原，產 生CSFV主要結構蛋白；而且E2基因也是豬瘟病毒中最易突變的基因，所以國內外對豬瘟 的研究多集中在E2基因，E2蛋白是CSFV新型診斷抗原的首選蛋白。
[0007] 本發明對國內外CSFV E2基因編碼的抗原結構研究的基礎上，通過已發表的不同 病毒株E2基因序列進行比較，進而找出各毒株之間主要抗原結構的差異；同時通過簡并 引物對E2進行PCR，經桿狀病毒表達系統對E2進行表達、純化。抗原通過膠體金試紙條包 被基因重組的E2對全國不同豬瘟病毒株免疫的豬血清都能進行特異、靈敏的檢測，為豬瘟 病毒的大批量現場檢測，流行病學調查具有重要的意義；同時有效地促進豬重大疫病的監 測與凈化工作，對提高我國養豬業生產的整體技術水平和公共衛生安全，發揮巨大經濟與 社會效益。
【發明內容】
[0008] 發明目的：為了克服上述現有技術的不足，本發明的目的在于提供方便、快捷的用 于檢測及其豬瘟病毒膠體金檢測試紙條，檢測豬全血、血漿或者血清標本中豬瘟病毒抗體， 用于豬瘟病的輔助治療。
[0009] 本發明的另一目的是提供上述試紙條的制備方法。
[0010] 技術方案：本發明提供的一種豬瘟病毒抗體膠體金檢測試紙條，其包括：同時包 被豬瘟病毒E2蛋白、合成多肽及特定多肽三條帶的硝酸纖維膜，含有膠體金標記的豬藍耳 病毒N蛋白的玻璃纖維膜。
[0011] 其中，所述豬瘟病毒E2蛋白為在對豬瘟病毒E2基因編碼的抗原結構研究的基礎 上，通過對已發表的不同病毒株E2基因序列進行比較，進而找出各毒株之間主要抗原結 構的差異；同時通過簡并引物對E2進行PCR，經桿狀病毒表達系統對E2進行表達、純化，再 經桿狀病毒表達載體表達制備獲得。
[0012] 作為優選，所述硝酸纖維膜中，豬瘟病毒E2蛋白的濃度為0. 15±0. 01mg/ml，合成 多肽的濃度為2· 0±0· 1 mg/ml。
[0013] 作為另一種優選，所述玻璃纖維膜中，膠體標記的豬瘟病毒E2蛋白的pH值為 5. 0~5. 4,膠體金和豬藍耳N蛋白的配比為以36 μ g蛋白/ml膠體金。
[0014] 作為另一種優選，還包括反應支持物（13)、免疫膠體金金標墊（12)和吸水墊 (11)，所述反應支持物（13)上依次相互搭接粘貼的免疫膠體金金標墊（12)、硝酸纖維膜 (10)和吸水墊（11)。
[0015] 作為進一步優選，所述反應支持物（13)為PVC板；吸水墊（11)為濾紙；免疫膠體 金金標墊（12)為聚酯膜、玻璃纖維或濾紙纖維。
[0016] 本發明還提供了上述豬瘟病毒膠體金檢測試紙條的制備方法，包括如下步驟： 1) 通過對不同病毒株E2基因序列比較，找出各毒株之間主要抗原結構的差異； 2) 通過簡并引物對E2蛋白進行PCR，經桿狀病毒表達系統對E2進行表達、純化； 3) 硝酸纖維膜的制備：將E2蛋白稀釋成0. 15±0.01 mg/ml，將合成多肽的濃度稀釋成 2. 0±0. 1 mg/ml和0. 2±0. 01 mg/ml噴于硝酸纖維膜上，分別形成檢測線、對照線和質檢 線，且在37°C中干燥2小時，備用； 4) 玻璃纖維膜的制備：將膠體金調整pH值為5. 0~5. 4,膠體金和豬瘟病毒E2的配 比為以36 μ g/ml膠體金，經穩定劑(含0. 05% BSA，PH8. 0, 0.0 lMTris緩沖液)處理后，按每 平方厘米65 μ 1的量均勻吸附于玻璃纖維膜上，冷凍干燥，備用； 5) 在反應支持物上依次相互搭接粘貼免疫膠體金金標墊（12)、硝酸纖維膜和吸水墊， 即得。
[0017] 其中，所述簡并引物為：
[0018] 本發明還提供了上述豬瘟病毒膠體金檢測試紙條在豬瘟病毒中檢測的應用。
[0019] 有益效果：本發明提供的試紙條利用膠體金標記技術和膜層析技術，用于快速定 性半定量對全國不同豬痕病毒株免疫的豬血清能進行特異、靈敏的檢測，達到快速篩檢病 豬，及時控制疫情的目的。方便、快速、簡捷，節省了大量的人力物力，不需要特殊儀器設備， 不需要專業培訓，結果清晰易辨，操作簡單，易于推廣，適合基層，適合于突發事件的大批量 現場檢測，適合流行病學調查，對豬瘟病毒的感染診斷起到輔助治療作用。
[0020] 本發明在對豬瘟病毒E2基因編碼的抗原結構研究的基礎上，通過對已發表的不 同病毒株E2基因序列進行比較，進而找出各毒株之間主要抗原結構的差異；同時通過簡 并引物對E2進行PCR，經桿狀病毒表達系統對E2進行表達、純化。抗原通過膠體金試紙條 包被基因重組的E2對全國不同豬瘟病毒株免疫的豬血清能進行特異、靈敏的檢測，對豬瘟 病毒的感染診斷起到輔助作用。
【附圖說明】
[0021] 圖1為本發明所述豬瘟病毒抗體檢測試紙條的主視圖； 圖2為本發明所述豬瘟病毒抗體檢測試紙條的右視圖； 其中卡體；2檢測窗孔；3加樣孔；4透氣孔；5質控線C1 ;6豬瘟病毒重組蛋白的判 斷線T ; 7指示體內抗體是否具有保護作用的指示線C2 ;8樣品墊；9濾血膜；10硝酸纖維 素膜（Cl，T，C2) ;11吸水墊；12免疫膠體金金標墊；13反應支持物。
[0022] 圖3為檢測試紙條檢測結果示意圖。從左至右依次為：T、Cl、C2三條線陽性；C1 和C2兩條線陰性、C1 一條線陰性陰性，無效。
[0023] 圖4為限制性內切酶BamHI和Xhol分別雙酶切質粒pFastBac載體和PCR擴增產 物的瓊脂糖凝膠電泳圖。
[0024] 圖5為質粒DNA測序圖： 圖6為豬痕病毒遺傳發生樹。
【具體實施方式】
[0025] 以下實施例用于說明本發明，但不用來限制發明的范圍；若未特別指明，實施例中 所用的技術手段為本領域技術人員說熟知的常規手段。
[0026] 實施例1豬瘟病毒E2蛋白的克隆及表達 (1)目的基因的獲得 利用國際互聯網（Internet)調出了豬瘟病毒基因庫（GenBank)中庫存的14個國外豬 瘟病毒的E2基因序列，加上國內所測的E2基因序列，利用計算機專用軟件完成了豬瘟 病毒遺傳發生樹的繪制。
[0027] 對E2基因的蛋白質序列和基因序列進行比對，根據比對結果及本發明對國內外 CSFV E2基因編碼的抗原結構研究基礎上，通過簡并引物對E2進行PCR。
[0028] 其中，簡并引物為：
[0029] 擴增出目的片段N，擴增條件：94 °C變性3 min，94 °C 45 S，56 °C復性90 S， 72°C延伸80 S，進行30個循環，最后72 °C延伸10 min。
[0030] (2)目的基因的克隆和陽性重組子的篩選 使用限制性內切酶BamHI和Xhol分別雙酶切質粒pFastBac載體和PCR擴增產物，瓊脂 糖凝膠電泳后（圖4)，切取含有目的片段的凝膠，使用TaKaRa試劑盒回收并純化目的片段。 使用T4 DNA Ligase將回收的載體片段和插入片段連接，連接產物轉化大腸桿菌DH5a感 受態細胞。從平板上挑取單菌落，搖菌提取質粒DNA，酶切鑒定正確的質粒送測序進一步驗 證，測序圖見圖5。
[0031] (3)重組轉移質粒轉化大腸桿菌DHlOBac感受態細胞 大腸桿菌DHlOBac含有卡那霉素抗性的桿粒bM0N14272和四環素抗性的輔助質粒 PM0N7124,因此在培養過程中需要加入終濃度為50 μ g/mL的卡那霉素和10 μ g/mL的四環 素。其感受態細胞的制備方法與前述大腸桿菌感受態細胞的制備方法相同。
[0032] 在重組轉移質粒轉化DHlOBac感受態細胞時，通過位點特異性轉座作用，轉移載 體上的外源基因插入到bacmid的革E位點上，從而形成重組bacmid。轉化操作如下：從-70°C 取出DHlOBac感受態細胞，冰上解凍后，加入1 μ L重組轉移質粒，輕輕吹打混勻。將混合物 置冰浴30min，42°C水浴熱擊45s，立即冰浴2min，加入900 μ L LB液體培養基，37°C，225 rpm振蕩培養4 h。取培養物用新鮮的LB液體培養基稀釋100倍后，吸取100 μ L涂布LB 三抗平板(含50 μ g/mL卡那霉素，7 μ g/mL慶大霉素，10 μ g/mL四環素，40 μ g/mL IPTG， 100 μ g/mL X-gal)，37 °C倒置培養4