一種檢測農作物中甲基硫菌靈殘留的試紙及其應用、制備方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及一種檢測農作物中甲基硫菌靈殘留的試紙及其應用、制備方法，屬于 甲基硫菌靈檢測技術領域。
【背景技術】
[0002] 甲基硫菌靈又名甲基托布津，是一種廣譜性內吸低毒殺菌劑，具有保護、治療和內 吸作用，屬于苯并咪唑類，它在植物體內轉化為多菌靈，干擾菌的有絲分裂中紡錘體的形 成，影響細胞分裂，具有高效、廣譜、低毒的特點，能夠有效防治多種作物的病害。在實際生 產中，常使用甲基硫菌靈對煙草白粉病、赤星病、萎蔫病、白絹病、蛙眼病等真菌病害進行控 制和治療。
[0003] 由于甲基硫菌靈為致癌可疑物，所以各國對甲基硫菌靈的殘留限量制定了嚴格的 標準。
[0004] 從現有技術和相關檢測標準看，目前針對甲基硫菌靈殘留的最常用的檢測方法是 HPLC，儀器方法具備檢測靈敏度高、特異性強等優勢，但是檢測樣本前處理繁瑣、耗時，樣品 還需提取和凈化處理，同時儀器檢測方法需要昂貴的大型儀器和設備，配備專業的檢測技 術人員，所以限制了其應用。因此，尋求更為快速的檢測手段，具有重要的現實意義。
【發明內容】
[0005] 本發明要解決的技術問題是:提供一種檢測農作物中甲基硫菌靈殘留的試紙及其 應用、制備方法，具有操作簡便、靈敏度高、成本低、制作方便，檢測時間短等優點，可以克服 現有技術的不足。
[0006] 本發明的技術方案是:一種檢測農作物中甲基硫菌靈殘留的試紙，包括樣品吸收 墊、結合物釋放墊、反應膜、吸水墊和底板，所述反應膜上具有包被有甲基硫菌靈偶聯抗原 的檢測線(T線)和包被有羊抗鼠抗抗體的質控線(C線），所述結合物釋放墊包被有甲基硫菌 靈單克隆-膠體金標記物。
[0007] 所述甲基硫菌靈偶聯抗原是由甲基硫菌靈半抗原與載體蛋白偶聯得到，所述載體 蛋白可為牛血清白蛋白、卵清蛋白、血藍蛋白、甲狀腺蛋白或人血清白蛋白。
[0008] 所述甲基硫菌靈單克隆抗體-膠體金標記物是將甲基硫菌靈單克隆抗體加入膠體 金中得到，其中所述膠體金是由檸檬酸三鈉與氯金酸反應制取得到。
[0009] 所述甲基硫菌靈單克隆抗體是用甲基硫菌靈半抗原-載體蛋白偶聯物免疫小鼠， 然后將小鼠脾細胞和骨髓瘤細胞通過融合、篩選得到。
[0010] 所述甲基硫菌靈半抗原是由甲基硫菌靈水解反應得到，其分子結構式為：
[0011] 所述樣品吸收墊、結合物釋放墊、反應膜、吸水墊依次粘貼在底板上，其中所述結 合物釋放墊1/3-1/2被覆蓋于樣品吸收墊下。
[0012] 本發明還提供一種制備上述試紙的方法，其包括以下步驟： 1) 制備包被有甲基硫菌靈單克隆抗體-膠體金標記物的結合物釋放墊(2); 2) 制備具有包被有甲基硫菌靈偶聯抗原的檢測線和包被有羊抗鼠抗抗體的質控線的 反應膜； 3) 將1)和2)制備好的結合物釋放墊、反應膜與樣品吸收墊、吸水墊和底板組裝成試紙。
[0013] 具體地說，步驟包括： 1) 半抗原制備:將甲基硫菌靈直接水解得到甲基硫菌靈的半抗原，反應過程中嚴格控 制氫氧化鈉的用量； 2) 將甲基硫菌靈半抗原與載體蛋白偶聯，得到甲基硫菌靈半抗原-載體蛋白偶聯物； 3) 用甲基硫菌靈半抗原-載體蛋白偶聯物免疫小鼠，將小鼠脾細胞和骨髓瘤細胞通過 融合、篩選，得到甲基硫菌靈單克隆抗體； 4 )提取小鼠 I gG免疫健康山羊，得到羊抗鼠抗抗體； 5) 用檸檬酸三鈉與氯金酸反應制備膠體金； 6) 將步驟3)制備的甲基硫菌靈單克隆抗體加入步驟5)制備的膠體金中，得到甲基硫菌 靈單克隆抗體-膠體金標記物； 7) 將甲基硫菌靈單克隆抗體-膠體金標記物包被在結合物釋放墊上，37 °C烘60min后取 出，密封并置于干燥環境中保存備用； 8) 甲基硫菌靈半抗原-載體蛋白偶聯物包被在反應膜上構成檢測線(T線），并將羊抗鼠 抗抗體包被在反應膜上構成質控線(C線）； 9) 將樣品吸收墊用含0.5%牛血清白蛋白（體積百分含量）、pH為7.2、0. lmo 1/L磷酸鹽緩 沖液浸泡2h，37 °C下烘干2h; 10) 在底板上按順序粘貼上樣品反應膜、吸水墊、樣品吸收墊、結合物釋放墊、，樣品吸 收墊蓋住結合物釋放墊，最后切成3mm寬的小條，加塑料盒，密封包裝，4-30°C條件下可保存 12個月。
[0014] 本發明另外還提供一種應用上述試紙檢測農作物中甲基硫菌靈殘留的方法，它包 括步驟： (1) 樣品前處理； (2) 用試紙進行檢測； (3) 分析檢測結果。
[0015] 本發明的有益效果是： 本發明的甲基硫菌靈快速檢測試紙采用高度特異性的抗體、抗原反應及免疫層析分析 技術，將甲基硫菌靈單克隆抗體-膠體金標記物固定于結合物釋放墊上，樣品中的甲基硫菌 靈在流動過程中，先與結合物釋放墊上的甲基硫菌靈單克隆抗體-膠體金標記物，形成藥 物-抗體-膠體金標記物。樣本中的藥物與反應膜檢測線上的甲基硫菌靈偶聯抗原競爭結合 甲基硫菌靈單克隆抗體-膠體金標記物，根據檢測線紅色條帶有無或顏色深淺來判斷待測 樣品液中甲基硫菌靈殘留量。經發明人測試，本發明試紙對新鮮煙葉的檢測限為〇.6mg/kg， 干煙葉的檢測限為1.5mg/kg。
[0016] 檢測時，樣品經處理后滴入試紙卡孔內，當甲基硫菌靈在樣品中的濃度低于檢測 限或為零時，甲基硫菌靈單克隆抗體-膠體金標記物在層析過程中會與固定在反應膜上的 甲基硫菌靈半抗原-載體蛋白偶聯物結合，在檢測線(T線)和質控線(C線）內各出現一條紅 色條帶;如果甲基硫菌靈在樣品中的濃度等于或高于檢測限，甲基硫菌靈單克隆抗體-膠體 金標記物會與甲基硫菌靈全部結合，從而在T線處因為競爭反應不會與甲基硫菌靈半抗原-載體蛋白偶聯物結合而不出現紅色條帶。如附圖3所示。
[0017] 陰性：當質控線(C線）顯示出紅色條帶，檢測線(T線）同時也顯示出紅色條帶，判為 陰性。
[0018] 陽性：當質控線(C線）顯示出紅色條帶，而檢測線(T線)不顯色，判為陽性。
[0019] 無效：當質控線（C線）不顯示出紅色條帶，則無論檢測線（T線）顯示出紅色條帶與 否，該試紙判為無效。
[0020] 本發明的試紙具有靈敏度高、特異性強、檢測成本低、操作簡單、檢測時間短、適合 各種單位使用、儲存簡單、保質期長的優點，是理想的快速篩選手段，能夠更好地滿足現場 快速檢測的要求。用本發明試紙檢測甲基硫菌靈殘留的方法簡便、快速、直觀、準確、適用范 圍廣、成本低、易推廣使用，特別適合用于煙草中甲基硫菌靈殘留的定性及半定量檢測。
【附圖說明】
[0021] 圖1:甲基硫菌靈半抗原合成路線圖； 圖2:試紙剖面結構示意圖； 圖3:試紙檢測結果判定圖。
【具體實施方式】
[0022] 為使本發明的目的、技術方案和優點更加清楚，下面將結合附圖對本發明作進一 步地詳細描述。
[0023]實施例1甲基硫菌靈檢測試紙的制備 該試紙的制備方法主要包括以下幾個步驟： 1) 制備包被有甲基硫菌靈單克隆抗體-膠體金標記物的結合物釋放墊2; 2) 制備具有包被有甲基硫菌靈偶聯抗原的檢測線5和包被有羊抗鼠抗抗體的質控線6 的反應膜3; 3) 將1)和2)制備好的結合物釋放墊2、反應膜3與樣品吸收墊1、吸水墊4和PVC底板7組 裝成試紙。
[0024]下面分步詳細敘述： 1、甲基硫菌靈半抗原的制備 將甲基硫菌靈直接水解得到甲基硫菌靈的半抗，反應方程如圖1所示，反應過程中嚴格 控制氫氧化鈉的用量。
[0025] 2、免疫原制備 甲基硫菌靈半抗原與牛血清白蛋白（BSA)偶聯得到免疫原。具體方法為:稱取以上半抗 原40.6mg，分別溶解于3mL N，N-二甲基甲酰胺溶液，分別加入NHS/EDC混合水溶液，活化6小 時；活化后溶液分別加入到BSA溶液中（含BSA 220mg)，調pH 8左右，室溫反應24小時，轉到 透析袋中于PB溶液中透析3天，每天早晚換液，得到甲基硫菌靈免疫原。
[0026] 3、甲基硫菌靈單克隆抗體的制備 (1)動物免疫 將步驟2得到的免疫原注入Balb/c小鼠體內，免疫劑量為150ug/只，使其產生抗血清。 [0027] (2)細胞融合和克隆化 小鼠血清測定結果較高后，取其脾細胞，按8:1 (數量配比）比例與SP2/0骨髓瘤細胞融 合，采用間接競爭ELISA測定細胞上清液，篩選陽性孔。利用有限稀釋法對陽性孔進行克隆 化，直到得到分泌甲基硫菌靈單克隆抗體的雜交瘤細胞株。
[0028]細胞凍存和復蘇:將單克隆雜交瘤細胞株用凍存液制成1 X 106個/ml的細胞懸液， 在液氮中長期保存。復蘇時取出凍存管，立即放入37°C水浴中速融，離心去除凍存液后，移 入培養瓶內培養。
[0029] 單克隆抗體的生產與純化:將Balb/c小鼠腹腔注入滅菌石蠟油0.5ml/只，7天后腹 腔注射穩定的單克隆雜交瘤細胞株5X105個/只，7天后采集腹水。用辛酸-飽和硫酸銨法進 行腹水純化，-20 °C保存。
[0030] (3)細胞凍存和復蘇 將雜交瘤細胞用凍存液制成1 X 1〇6個/ml的細胞懸液，在液氮中長期保存。復蘇時取出 凍存管，立即放入37°C水浴中速融，尚心去除凍存液后，移入培養瓶內培養。
[0031 ] (4)單克隆抗體的制備與純化 增量培養法:將雜交瘤細胞置于細胞培養基中，在37°C條件下進行培養，用辛酸-飽和 硫酸銨法將得到的培養液進行純化，得到單克隆抗體，-20°C保存。
[0032]所述細胞培養基為向RPMI1640培養基中添加小牛血清和碳酸氫鈉，使小牛血清在 細胞培養基中的終濃度為20%(質量百分含量），使碳酸氫鈉在細胞培養基中的終濃度為 0.2%(質量百分含量）;所述細胞培養基的pH為7.4。
[0033] 5、羊抗鼠抗抗體的制備 以羊作為免疫動物，以鼠源抗體為免疫原對無病原體羊進行免疫，得到羊抗鼠抗抗體。 [0034] 6、單克隆抗體-膠體金標記物的制備 (1)膠體金的制備 用雙蒸去離子水將1%氯金酸稀釋成0.01%(質量百分含量），取l〇〇ml置于錐形瓶中，用 恒溫電磁攪拌器加熱至沸騰，在持續高溫、持續攪拌下加入2.5ml 1%梓檬酸三鈉，繼續勻速 攪拌加熱至溶液呈透亮的紅色時停止，冷卻至室溫后用去離子水恢復到原體積，4°C保存。 制備好的膠體金外觀純凈、透亮、無沉淀和漂浮物。
[0035] (2)金標抗體的制備 在磁力攪拌下，用〇. 2mol/L碳酸鉀溶液調膠體金的pH值至7.0，按每毫升膠體金溶液中 加入20-