一種檢測多靶標的自驅動微流體檢測卡的制作方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及微流體制作領域，更具體地，涉及一種自驅動微流體檢測卡制作方法。
【背景技術】
[0002]微流體技術為蛋白的檢測提供了一個有效的手段，其優點在于通過微通道中微流控操作，大大降低了樣品及其試劑的消耗，并且有效提高了檢測的速度;微流體技術還具有體積小、便于攜帶等特點，從而有利于開發成床旁實時監測技術(point of care test，POCT) ο
[0003]然而，微流體中微通道的制作仍是微流體發展的最大技術難點。常用的微通道制作方法，如注塑、熱壓、光刻等，都有著自身的缺陷，并且微通道的組裝及鍵合也是微通道需要解決的問題，常用的鍵合方式如超聲焊接、有機粘合等方式也存在著相應的缺陷。
[0004]如專利CN200510023895提供了一種使用SU-8膠光刻制作微通道，使用稀釋的SU-8膠作為微通道的鍵合方法，在一定程度上解決了微通道的制作問題。但是，該方法仍會出現通道制作過程中的堵塞狀況，而且其制作過程依舊相對繁瑣。
[0005]將捕獲抗體或者其他靶標分子高效的固定在微通道的表面是建立高質量微流體檢測關鍵問題。常用的固定方式分為物理吸附和共價連接兩種方式。物理吸附法固定蛋白會改變蛋白的空間構象因而固定效率相對較低。常用的共價固定方法又存在著操作步驟相對繁瑣的問題。
[0006]如專利CN03157199、CN201110346431、CN201010045620分別提供了各自的在芯片表面固定蛋白的方法，有效解決了蛋白在芯片表面的固定，提高了蛋白在芯片表面的固定效率。但是，這些方法的操作步驟依I日相對繁瑣。
[0007]微流體的驅動方式一般來說主要有兩種，外力驅動和自驅動。外力驅動是通過外在的動力源進行流體的驅動，比如，借助馬達、微栗、外壓、出口負壓等方式進行液體的驅動，這類驅動方式對微流體的加工要求較高，并且需要借助外在的儀器或裝置，從而會增加檢測的成本。自驅動是微流體本身不借助外在裝置而液體能夠進行自主流動的方式，比如，通過液體的重力、表面張力等方式進行液體的自主流動。自驅動不依賴于外在的裝置來控制液體的流動相對能夠降低檢測成本。
[0008]如專利CN201380018250提供了一種利用液體在通道內的表面張力和控制出口壓力的方式控制液體在微通道內流動的方式，有效地控制了液體在微通道中的流動。但是，該檢測卡設計復雜，通道仍需要繁瑣的步驟制備，仍然部分依賴于出口壓力的控制。
[0009]而專利CN201210329604提供了一種完全依賴于流體重力驅動微流體流動的方法，有效地擺脫了外部裝置的依賴，提供了一種檢測的思路。
[0010]使用微流體檢測技術進行多靶標的檢測能夠進一步的降低檢測成本，而且多靶標的同檢能夠提高檢測的準確度和特異性。
[0011]專利CN201210142337提供了一種多靶標同檢的微流體檢測技術，能夠通過一部進樣同時進行多種指標的檢測，大大降低了檢測的成本。但是，該微流體的制作難度仍相對較大，仍需要外在的驅動作為樣品在微通道中的作用力，因而檢測成本仍相對較高。
[0012]因此，建立一種制作簡便的不依賴于外力驅動的能夠進行多靶標檢測的微流體檢測技術具有重要的意義。
【發明內容】
[0013]本發明要解決的第一個技術問題在于提供一種制作簡便的高靈敏度多靶標檢測的自驅動微流體檢測卡。
[0014]為達到上述目的，本發明采用下述技術方案:
[0015]—種檢測多靶標的自驅動微流體檢測卡，其包括底板、上蓋和位于上蓋和底板之間的雙面膠層，其中雙面膠層具有微通道，該自驅動微流體檢測卡的制備方法包括如下步驟:
[0016]制備具有微通道的雙面膠層；用馬來酸酐基團修飾底板的材料表面;將雙面膠層粘貼到馬來酸酐修飾的底板表面;在微通道固定捕獲抗體和儲存標記抗體;將所述上蓋粘貼到上述處理過的雙面膠層上，其中所述微通道包括進樣口、標記抗體儲存區、第一時間控制通道、第二時間控制通道、反應檢測區以及廢液區。
[0017]使用計算機畫圖軟件，如solidworks、CAD，畫出設計好的的底板、雙面膠層、雙面膠層微通道和上蓋的形狀。通過激光打印技術，又稱為激光切割技術，分別在所述底板材料、雙面膠層材料、上蓋材料上使用激光切割出相應的形狀。
[0018]所述標記抗體儲存區為檢測所使用標記抗體固定儲存區；所述第一時間控制通道為標記抗體與樣本的混合時間的窄通道，該通道由至少一個S型通道或者至少一個Z型通道構成，液體流通時經過彎曲通道時與通道邊緣的撞擊能夠有效地提高樣本與標記物的混合程度，同時該通道能夠延長樣本與標記物的反應時間從而使樣本中的靶標(待測物)與標記抗體充分反應形成靶標-標記物的復合物;所述第二時間控制通道為延長樣本在檢測區的反應時間的窄通道，該通道由至少一個S型通道或者至少一個Z型通道或者一段窄的直通道構成，目的為提高靶標-標記物的復合物與捕獲抗體的反應程度形成捕獲抗體-靶標-標記物的復合物，由于第二時間控制通道的存在，使反應區的溶液流向廢液池中的速度減慢，也就是溶液在反應區的停留時間加長，使反應區的溶液能充分與捕獲抗體反應，進而提高復合物的反應程度;所述反應檢測區為固定捕獲抗體、背景校正試劑及其他校準試劑的區域；所述廢液區為收集流過檢測區的樣本的區域。
[0019]優選地，反應檢測區固定不同抗原的捕獲抗體。
[0020]優選地，捕獲抗體與標記抗體結合于目標抗原的不同表位。
[0021 ]優選地，標記抗體的標記物為磁珠、熒光、膠體金或膠體銀，更優選地熒光微球、熒光分子或量子點。
[0022]所述上蓋包括進樣口和透氣孔。其中上蓋與雙面膠層黏合后，上蓋的進樣口和雙面膠層上的進樣口重合。優選地，所述透氣孔為I個以上，所述透氣孔位于與雙面膠層廢液區相應的上蓋處。
[0023 ]所述上蓋的材料為透光性較好的高聚物材料，選自但不限于PMMA、PS、PC或PET，優選為PMMA或PS。當所述高聚物材料為親水材料時可直接使用；當所述高聚物材料為疏水材料時需對疏水材料進行親水性修飾，例如涂覆一層親水性薄層或采用物理修飾方法，優選地，采用等離子體處理技術進行親水性修飾。
[0024]所述等離子體處理技術進行親水性修飾所用溶液為酸溶液、堿溶液或中性溶液，優選地，使用水進行親水性修飾，優選地，在水溶液浸泡時間為1-24h，更優選地，浸泡2h。
[0025]所述馬來酸酐基團修飾底板的材料為含有馬來酸酐的聚合物，包括接枝聚合物和嵌段共聚物。所述含有馬來酸酐的聚合物選自聚苯乙烯-馬來酸酐聚合物、聚苯丙烯-馬來酸酐聚合物和聚氧乙烯-馬來酸酐聚合物中的一種或多種，優選聚苯乙烯-馬來酸酐聚合物，接枝率優選0.5%-17 %。
[0026]優選地，所述用馬來酸酐基團修飾底板的材料表面的方法為:使用提拉法涂膜技術在底板表面使用聚苯乙烯-馬來酸酐聚合物的溶液中進行修飾，在底板材料表面引入馬來酸酐基團。所述馬來酸酐基團可以用于固定捕獲抗體。
[0027]所述的底板材料為單晶硅、玻璃或高聚物材料，如高聚合度的有機玻璃(Polymethylmethacrylate ,PMMA)、丙稀臆-丁二稀-苯乙稀(Aery1nitriIe-Butadiene-Styrene，ABS)、聚氯乙稀(PolyVinyIChloride，PVC)聚碳酸酯(Polycarbonate，PC)等，優選地，使用高聚合度的PMMA。
[0028]所述含有馬來酸酐聚合物的溶液為含有馬來酸酐的聚合物溶于有機溶液中獲得的溶液。優選地，所述聚苯乙烯馬來酸酐聚合物溶液為聚苯乙烯-馬來酸酐聚合物溶于有機溶液中獲得的溶液。所述有機溶劑選自丙酮、氯仿、甲苯和二氯乙烷中的一種或多種，優選地為甲苯。
[0029]所述底板、上蓋和雙面膠層進一步包括定位結構。利用定位結構將雙面膠層粘貼到底板表面，同時利用定位結構將上蓋粘貼到雙面膠上。
[0030]優選地，采用聚苯乙烯