一種檢測大豆凝集素的酶聯免疫試劑盒的制作方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及酶聯免疫和獸藥殘留監測分析技術領域中的一種檢測大豆凝集素的 酶聯免疫試劑盒。
【背景技術】
[0002] 大豆凝集素 （Soybean Agglutinin SBA)作為一種抗營養因子主要存在于飼料、食 品等豆類制品中，由于其能凝集紅細胞，影響營養物質的消化吸收、抑制動物生長，導致過 敏反應等，在動物和人體內引發一系列抗營養作用，嚴重影響動物生長及人類健康，因此準 確檢測飼料、食品中大豆凝集素的含量具有重要意義。雖然檢測大豆凝集素的方法很多，但 是都存在著一定的缺陷，不能對具有生物學性的大豆凝集素完全定量，而試劑盒價格昂貴， 且只能檢測具有免疫學活性的大豆凝集素。本研究通過制備抗SBA單克隆抗體，根據其能 凝集紅細胞的特性。建立了快速、準確、穩定的檢測大豆凝集素含量的功能性ELISA法。
[0003] 目前國內外關于大豆凝集素的檢測方法很多，根據大豆凝集素的凝集活性和免疫 活性分為紅細胞凝集反應法和免疫測定法。但是紅細胞凝集反應法只能檢測出具有凝集活 性的大豆凝集素，對大豆凝集素進行定性及半定量測定。而免疫測定法所使用的抗體大多 是自制的多克隆抗體，其特異性較差。一些大豆凝集素 ELISA檢測試劑盒采用雙抗體夾心 法只能進行半定量，且價格昂貴。故此，本發明采用了高特異性的抗大豆凝集素的單克隆抗 體，并建立了檢測大豆凝集素含量的功能ELISA方法。 發明創造內容
[0004] 本發明的目的是提供一種檢測本發明的目的是提供一種檢測大豆凝集素的酶聯 免疫試劑盒。
[0005] 本發明所提供的檢測大豆凝集素的酶聯免疫試劑盒，包括包被的大豆凝集素與載 體蛋白的偶聯物，所述大豆凝集素的特異性抗體和酶標二抗。
[0006] 為了更方便現場監控和大量樣本篩查，所述試劑盒還包括A，B，C，D，E，F試 劑液、G試劑液、Η試劑液、I試劑液、J試劑液、K試劑液、L試劑液和Μ試劑液。
[0007] 所述A，B，C，D，E，F試劑液為大豆凝集素系列濃度標準溶液。
[0008] 所述G試劑液為蛋白濃度為0· 1 - 10mg/L的酶標二抗。
[0009] 所述Η試劑液為蛋白濃度為0. 1 - 10mg/L的大豆凝集素單克隆抗體。
[0010] 所述I試劑液為四甲基聯苯胺。
[0011] 所述J試劑液為含〇. 1 - l〇%BSA的磷酸鹽緩沖液。
[0012] 所述K試劑液為含0. 05%吐溫的磷酸鹽緩沖液。
[0013] 所述L試劑液為檸檬酸緩沖液。
[0014] 所述Μ試劑液為終止液。
[0015] 所述大豆凝集素的特異性抗體為大豆凝集素單克隆抗體；所述大豆凝集素單克隆 抗體為鼠源抗體，所述多西環素單克隆抗體優選為大豆凝集素鼠克隆抗體。
[0016] 以上抗體均可用大豆凝集素與載體蛋白的偶聯物作為免疫原按常規方法制備。
[0017] 所述載體蛋白為所述載體蛋白可謂牛血清蛋白（BSA)等常用載體蛋白；所述大豆 凝集素與載體蛋白的偶聯物可采用甲醛法、聯氨法、重氮化法或EDS法合成。
[0018] 所述標記酶可謂辣根過氧化物酶或堿性磷酸酯酶，優選為辣根過氧化物酶；所述 二抗可為抗鼠抗體。
[0019] 可作為固定大豆凝集素與載體蛋白的偶聯物的載體的物質很多，如聚苯乙烯等。 該載體的形式可以是試管、微量反應板凹孔、小珠、小圓片等。
[0020] 在優選的條件下，本發明的檢測大豆凝集素的酶聯免疫試劑盒，包括包被的與大 豆凝集素載體蛋白的偶聯物，大豆凝集素的特異性抗體和酶標二抗。
[0021] 本發明的檢測原理為將大豆凝集素與載體蛋白的偶聯物做包被原吸附于固相載 體上，加入樣品和特異性抗體，再加入酶標二抗，待測樣品中殘留的大豆凝集素和固相載體 上包被的大豆凝集素與載體蛋白的偶聯物競爭結合特異性抗體，顯色后終止，測定樣品吸 光值，該值與樣品中大豆凝集素殘留物含量呈負相關，與標準曲線比較即可得出大豆凝集 素的含量。同時根據酶標板上的樣品顏色的深淺，與系列濃度的大豆凝集素標準溶液顏色 的比較可判斷樣品的濃度范圍。
[0022] 本發明主要采用間接競爭ELISA方法定性或定量檢測大豆等樣品中大豆凝集素 的殘留量；對樣品的前處理要求低，樣品前處理過程簡單，能同時快速檢測大批樣品；最低 檢測限達10ng/mL以下，可直接判斷樣品是否超標，具有高特異性、高靈敏度、高精確度、高 準確度等特點，可在植物性性食品大豆凝集素殘留檢測中發揮重要作用。
【附圖說明】
[0023] 圖1為試劑盒的標準曲線。
【具體實施方式】
[0024] 實施例1、抗原及抗體的制備 (1)包被抗原的合成 選擇兔紅細胞膜包被酶標板作為功能ELISA捕獲大豆凝集素的載體，得到包被原。
[0025] (2)免疫(抗）原的合成 取凍干后的大豆凝集素，用滅菌的生理鹽水稀釋到適當的濃度，加入等體積的弗氏完 全佐劑FCA或者弗氏不完全佐劑FICA，然后用注射器雙推法混勻佐劑與免疫抗原，使其充 分混勻成油包水乳狀物，混勻后可用平皿取少量清水，將乳化液滴入清水中，如果乳化液形 成油滴，且不立即擴散溶解，即為乳化良好，可以用于免疫老鼠。
[0026] (3)抗大豆凝集素單克隆抗體的制備 動物免疫程序采用BALA / C小鼠作為免疫動物，以多西環素與牛血清白蛋白偶聯物 為免疫原，免疫劑量為50g(0. lmL)免疫原加等體積完全福氏佐劑乳化，進行首次皮下注射 免疫。一月后，取同樣量免疫抗原加等量不完全福氏佐劑乳化，進行加強免疫，再過一月后， 取同樣量免疫抗原不加佐劑腹腔注射進行加強免疫，之后5天采血，測定抗體效價，取脾細 胞。
[0027] 細胞融合與克隆化取免疫BALA、C小鼠脾細胞，按4:1比例與SP2/0骨髓瘤細胞 融合，采用間接競爭ELISA測定細胞上清液，篩選陽性孔。利用有限稀釋或軟瓊脂平板法對 陽性孔進行克隆化，得到完全同質的單克隆抗體和穩定的單克隆雜交瘤細胞株。
[0028] 細胞凍存和復蘇取處于對數生長期的雜交瘤細胞用凍存液制成106 - 5X 106個 /mL的細胞懸液，分裝于凍存管，在液氮中長期保存。復蘇時取出凍存管，立即放入37°C水 浴中速融，離心去除凍存液后，移入培養瓶內培養。
[0029] 單克隆抗體的制備與純化 采用體內誘生法，將BALA / C小鼠（8周齡）腹腔注入滅菌石蠟油0.5mL/只，7-14天 后腹腔注射雜交瘤細胞5X 105-106個/只，7-10天后采集腹水。經辛酸一硫酸銨沉淀法進 行腹水純化，小瓶分裝，-20 °C保存。
[0030] 二抗的制備 以羊作為免疫動物，以鼠或兔IgG為免疫原進行免疫，得到羊抗鼠或羊抗兔抗體。
[0031] 用高碘酸鈉法多戊二醛法合成辣根過氧化物酶一羊抗兔IgG或辣根過氧化物 酶一羊抗鼠 I gG標記物。
[0032] 實施例2、檢測大豆凝集素的酶聯免疫試劑盒 (1 )檢測大豆凝集素的酶聯免疫試劑盒的結構 該試劑盒主要由盒體、鋁膜真空包裝96/40孔孔酶標板、A，B，C，D，E，F試劑液(大 豆凝集素系列濃度標準溶液)、G試劑液(酶結合二抗)、H試劑液(大豆凝集素