一種高效液相色譜檢測油脂中4-hhe和4-hne的方法
【技術領域】
[0001] 本發明屬于分析檢測技術領域，具體涉及一種高效液相色譜檢測油脂中反式-4-羥基-2-己烯醛(4-HHE)和反式-4-羥基-2-壬烯醛(4-HNE)的方法。
【背景技術】
[0002] 無論是食品加工業還是家庭烹飪，熱處理都是不可或缺的一部分，加熱會加速油 脂以及富含脂質食品的氧化。油脂氧化會產生多種初級氧化產物和次級氧化產物，初級氧 化產物主要是氫過氧化物，但是氫過氧化物容易分解成次級氧化產物，例如醛類、酮、短鏈 烴，α，β-不飽和-4-羥醛就是醛類中重要的一類。α，β_不飽和-4-羥醛(結構式見附圖1)主要 有以下五種：
[0003] 1、R = C2H5:反式-4-羥基-2-己烯醛(4-ΗΗΕ);
[0004] 2、R = C4H9:反式-4-羥基-2-辛烯醛(4-H0E);
[0005] 3、R = C5H11:反式-4-羥基-2-壬烯醛(4-HNE);
[0006] 4、R = C6H13:反式-4-羥基-2-癸烯醛(4-HDE);
[0007] 5、R = C7H15:反式-4-羥基-2-^碳烯醛(4-HUE)。
[0008] 富含多不飽和脂肪酸的油脂容易氧化產生α，β-不飽和羥醛。在油脂過氧化反應過 程中，η-6系列的多不飽和脂肪酸(如亞油酸、花生四烯酸)會形成4-ΗΝΕ，η-3系列的多不飽 和脂肪酸(如DHA、EPA)會形成4-ΗΗΕ。由于魚肉富含η-3系列的多不飽和脂肪酸，過氧化容易 產生4-ΗΗΕ;動物肉以及大部分的植物油富含η-6系列的多不飽和脂肪酸，過氧化容易產生 4-HNE。
[0009] 1980年，Benedetti以及同事們發現肝微粒體脂質過氧化過程中產生的主要的細 胞毒素是4-HNE，這一發現引起了人們對α，β不飽和羥醛的興趣。羥醛的官能團有醛基、雙 鍵、羥基這三種，屬于比較活潑的物質，能夠與巰基和氨基發生反應進而可以修飾蛋白質、 核酸以及其他的生物分子，具有細胞毒性和致突變性。其中，4-ΗΝΕ是最具代表性的α，β不飽 和羥醛，因為4-ΗΝΕ的毒性最大，含量也較為豐富。4-ΗΝΕ參與低密度脂蛋白的改性，容易形 成動脈粥樣硬化;4-ΗΝΕ還可以與半胱氨酸、賴氨酸、組氨酸形成穩定的化合物。目前很多證 據表明4-ΗΝΕ與動脈粥樣硬化、海默病、帕金森綜合征、亨廷頓舞蹈病有關。數據顯示：100μΜ 以及更高濃度的4-ΗΝΕ可以引起急性毒性，導致細胞大量死亡；1-20μΜ范圍內，4-ΗΝΕ可以抑 制DNA和蛋白質的合成;甚至在更低的濃度（<0. ΙμΜ)，4-ΗΝΕ就可以影響細胞的新陳代謝。
[0010] 目前，國內對4-ΗΗΕ、4-ΗΝΕ的研究主要集中在醫學上，檢測的方法主要是利用試劑 盒以及免疫細胞組化檢測方法等。張莉在《香煙煙霧暴露對大鼠4-ΗΝΕ和γ -GCS表達的影 響》（山西醫科大學，2012)中采用了雙抗體夾心酶聯免疫吸附(ABC-ELISA)法檢測鼠 BALF及 外周血4-ΗΝΕ的含量。試劑盒以及免疫細胞組化檢測方法適用于生物樣本，而且成本也比較 高。國內對食品中4-HHE、4-ΗΝΕ的研究還比較少，沒有建立食品中4-HHE、4-ΗΝΕ的檢測方法。 目前國外文獻報道檢測食品中4-ΗΗΕ、4-ΗΝΕ的方法主要有HPLCXC-MSjPLC-MS^HNMI^， 但是近年來使用的這些方法大都需要衍生化，HPLC分析常用的衍生試劑是2,4_二硝基苯 肼，GC-MS常用的衍生試劑是五氟芐基羥胺鹽酸鹽和三甲基硅烷。但是衍生試劑只有基團針 對性，沒有物質針對性;而且前處理操作程序相對比較麻煩，此外衍生試劑成本比較高，GC-MS、HPLC-MS的成本也較HPLC高很多，且需要專業的人員進行操作，維護和使用的成本也較 尚。
【發明內容】
[0011] 本發明的目的就是為了克服上述現有技術存在的缺陷而提供一種高效液相色譜 檢測油脂中反式-4-羥基-2-己烯醛(4-HHE)和反式-4-羥基-2-壬烯醛(4-HNE)的方法。本方 法使用比較簡單的HPLC，不需要衍生樣品，前處理過程中實現了復雜的油脂樣品的提取凈 化，利用梯度洗脫實現樣品中4-HHE與4-HNE同時檢測。
[0012] 本發明的目的可以通過以下技術方案來實現：
[0013] -種高效液相色譜檢測油脂中4-HHE和4-HNE的方法，包括以下步驟：
[0014] (一）提取油脂中的4-HHE、4-HNE:取油脂，加入含有BHT的蒸餾水，渦旋、超聲后高 速離心后收集水層，然后再對油層重復上述加蒸餾水、渦旋、超聲的操作一次，將兩次收集 的水層合并，得到含有待檢測物4-HHE、4-HNE的澄清溶液；
[0015]具體操作時，可以參考的參數條件為：取lg油樣，加入10mL蒸餾水（含有10yL的 10mg/mL BHT溶液），禍旋2min，超聲3min，重復禍旋、超聲3次進行萃取，之后4500rpm轉速下 離心10min后收集水層，然后再對油層重復上述加蒸餾水、渦旋、超聲的操作一次，將兩次收 集的水層合并，得到含有待檢測物4-HHE、4-HNE的澄清溶液。
[0016](二）用萃取柱進行4-HHE、4-HNE的凈化：用甲醇活化C18萃取柱，再用水平衡C18萃 取柱，將含有待檢測物4-HHE、4-HNE的澄清溶液流經C18萃取柱，上樣結束后，先用石油醚洗 脫非極性物質，之后利用甲醇水混合溶液（甲醇、水體積比80: 20)將目標物洗脫，氮氣吹掃 去除石油醚，洗脫液定容，再對洗脫液進行濃縮，然后將濃縮液過0.22μπι的微孔過濾膜，待 用；
[0017]具體操作時，可以參考的參數條件為：首先用3mL甲醇活化C18萃取柱，再用3mL水 平衡C18萃取柱。然后將上一步驟得到的含有待檢測物4-HHE、4-HNE的澄清溶液上樣，上樣 結束后，先用15mL石油醚洗脫非極性物質，之后利用3mL甲醇水混合溶液（甲醇、水體積比 80:20)將目標物洗脫入2mL的容量瓶，氮氣吹掃去除石油醚，之后再用上述甲醇水混合溶液 定容至2mL，對洗脫液進行濃縮，然后將濃縮液過0.22μπι的微孔過濾膜，待用。
[0018] (三)利用HPLC進行分析，利用外標法進行定量:上述處理后濃縮液經HPLC檢測后， 根據4-HHE、4-ΗΝΕ的線性標準曲線，計算油脂中4-HHE、4-ΗΝΕ的含量。
[0019] 4-HHE、4-ΗΝΕ的線性標準曲線的制作方法為:分別配制濃度為0.4、1、4、10、20、40μ g/mL的4-HHE以及0.4、4、10、20、40yg/mL的4-ΗΝΕ標準溶液，經HPLC檢測(HPLC檢測條件與對 待檢測物的檢測條件相同）后，根據進樣濃度和對應色譜峰制成線性標準曲線。
[0020] HPLC檢測工藝為：高效液相色譜(Surveyor plus，美國Thermo公司）分別以水和甲 醇為流動相A和流動相B，以流速0.25~1. OmL/min進行梯度洗脫，在最初的2min內，水和甲 醇的體積比是70:30，在2~20min內，體積比線性變化為0:100，100 %甲醇維持5min，25.1~ 3〇11^11內水與甲醇的比例是70:30。
[0021] HPLC檢測使用的檢測器為光電二極管陣列檢測器，檢測波為220-225nm，柱溫為30 °C，進樣量為2~5yL。
[0022] HPLC檢測使用的色譜柱為反相C18柱，比較有代表性的有以下兩種規格:4.6mmX 150mm，2.7μηι; 4.6mm X 250mm，5μηι。色譜柱的規格不同，流速就不同。
[0023]與現有技術相比，本發明方法使用比較簡單的HPLC，不需要衍生樣品，前處理過程 中實現了復雜的油脂樣品的提取凈化，利用梯度洗脫實現樣品中4-ΗΗΕ與4-ΗΝΕ同時檢測。 本發明檢測方法簡單、穩定，成本相對較低。在油脂以及油炸食品的分析領域具有很重要的 意義。
【附圖說明】
[0024]圖1為α，β-不飽和-4-輕醛的結構式；
[0025]圖2為反式-4-羥基-2-己烯醛、反式-4-羥基-2-壬烯醛標準品的譜圖；
[0026] 圖3為油脂樣品的譜圖；
[002