一種檢測mmp-9功能的fret生物傳感器及其構建方法與應用
【技術領域】
[0001] 本發明涉及一種單分子型FRET生物傳感器及其構建方法與應用，具體涉及一種活 細胞中檢測MMP-9功能的單分子型FRET生物傳感器及其構建方法與應用。
【背景技術】
[0002] 骨性關節炎(Osteoarthritis，0A)作為一種慢性退行性疾病，多見于中老年人，其 致痛、致殘率高，嚴重影響老年人的生活質量。流行病學調查顯示，國內外60歲以上的老年 人0A患病率高達50%，且隨著年齡的增加患病率呈顯著上升趨勢。研究表明，0A的發生與年 齡、性別、免疫反應、骨內壓升高、酶對軟骨的降解、細胞因子等因素相關，另外與基因的多 態性也有較大關系。其中，由軟骨細胞所產生的參與細胞外基質及基底膜成分降解的蛋白 水解酶成為國內外學者研究0A發病機制的熱點，但其具體的發病機制仍然不清。最新的研 究表明，基質金屬蛋白酶(MMPs)在軟骨的退變中起著極其重要的作用，另外滑膜組織中巨 噬細胞系統可能是促使軟骨組織退變的關鍵環節，其誘導軟骨退變的主要因素是巨噬細胞 分泌的MMP-9,在正常穩定狀態組織中麗P-9表達量很少，而在炎性細胞因子、激素、生長因 子刺激下和細胞轉化過程中其表達量上升，因此研究MMP-9的功能和作用非常重要。然而近 幾年發展起來的生物技術均以細胞的破碎為代價，無法在活細胞狀態下研究蛋白質及分子 之間的相互作用，應用熒光共振能量轉移技術(FRET)并結合基因工程等技術正好彌補了這 一缺陷。
[0003] 目前，FRET是一種觀察活細胞內分子之間相互作用等的新技術，作為1~10nm距離 范圍內的光學"分子尺"，具有高分辨率、高靈敏度、簡單方便的優點，可以定時、定量、定位、 無損傷的檢測活細胞內蛋白質相互作用以及蛋白酶活性等;其基本原理是通過易于檢測的 熒光共振能量轉移的效率信息來反映兩分子團的距離信息，而距離接近到lOnm之間是兩分 子相互作用或一分子的兩個結構域因構象改變而相互靠近的有力證據。通過FRET效率的增 強可檢測分子間發生相互作用或構象改變而靠近;FRET效率的減弱可用于證明兩分子遠離 因而失去相互作用，或證明一個分子的兩個部分間因分子被切斷或構象改變而相互遠離。 FRET主要可分為分子內FRET和分子間FRET，即單分子型FRET和雙分子型FRET:前者指在一 個分子上標記兩個探針，檢測這個分子自身發生的一些變化；后者指在不同的兩個分子上 分別標記供體和受體探針，檢測這兩個分子之間的相互作用，受幾方面的影響，雙分子型 FRET不如單分子型FRET。因此，利用FRET原理將所要研究的目的蛋白和熒光蛋白連接在一 起構建融合蛋白，令其在細胞中表達，在一定條件下就可以研究蛋白質、各種分子之間相互 作用以及蛋白酶的活性了。但是在制作單分子型FRET生物傳感器時，特有的能量轉移有效 距離使得在涉及能量轉移體系時需要復雜的表面功能化、供受體熒光蛋白與目的蛋白之間 的化學鍵和制備步驟，其中，接頭序列（Linker)設計是基因融合技術能否成功的關鍵技術 之一，即通過一段適當的核苷酸序列將不同的目的基因連接起來，使其在適當的生物體內 表達成為一條單一的肽鏈，其中起連接作用的氨基酸稱為Linker。融合蛋白中的兩種成分 能否分別形成正確的空間結構、更好的發揮生物學活性，與連接融合蛋白中兩種成分的接 頭序列密切相關。重組生成的融合蛋白要求插入融合蛋白中的linker不能影響目的蛋白各 自的功能，因此，Linker序列的設計和選擇對融合基因的構建至關重要。由上述眾多因素導 致開發高靈敏度的單分子型生物傳感器受到了較大限制。
【發明內容】
[0004] 本發明所要解決的技術問題是，提供一種檢測MMP-9功能的FRET生物傳感器及其 構建方法與應用。
[0005] 本發明解決其技術問題采用的技術方案是，
[0006] 本發明之一種檢測MMP-9功能的FRET生物傳感器，所述FRET生物傳感器含有配體 MMP-9特異底物的蛋白與熒光供體和熒光受體蛋白構建的融合蛋白的真核表達載體。
[0007] 進一步，所述FRET生物傳感器還含有PCDNA3.1 ( + )質粒基因序列。
[0008] 進一步，所述配體MMP-9特異底物的蛋白由SEQ ID NO: 1所示的氨基酸序列組成。
[0009] 進一步，編碼所述配體MMP-9特異底物的蛋白的堿基序列如SEQ ID N0:2所示。
[0010] 進一步，所述熒光供體為ECFP;熒光受體為EYFP。
[0011] 本發明之一種檢測MMP-9功能的FRET生物傳感器的構建方法，包括以下步驟：
[0012] (1)熒光供體蛋白和熒光受體蛋白的基因克隆、鑒定:根據熒光供、受體蛋白質粒 的相應地基因序列設計兩對引物P1和P2，P3和P4,并在P1的5'端添加 Hind III酶切位點，P2 的5'端添加 BamHI酶切位點，P3的5'端添加 BamH I酶切位點和所述配體MMP-9特異底物的蛋 白的堿基序列、Linker堿基序列（GGSGGT-GGC GGC AGC GGC GGC ACC);在P4的5'端添加 EcoR頂每切位點，克隆含有上下游片段的熒光供、受體的基因全長序列；
[0013] (2)FRET生物傳感器的構建:將pcDNA3.1( + )和熒光供體的PCR產物分別進行Hind III和BamH I雙酶切處理，并將熒光供體的PCR產物插入pcDNA3.1( + )中，獲得中間重組子 pcDNA3.1( + )-ECFP;接著用BamH I和EcoR I雙酶切中間重組子pcDNA3.1( + )-ECFP和熒光受 體體的PCR產物，并將熒光受體的PCR擴增產物插入中間重組子pcDNA3.1 ( + )-ECFP，獲得重 組質粒載體MMP-9生物傳感器，并通過PCR、酶切、測序驗證克隆目的片段的準確性。
[0014] 進一步，步驟（1)中，所述焚光供、受體蛋白質粒選自PECFP-C1、pEYFP_Cl;相應地 克隆ECFP的引物對P1和P2,如SEQ ID NO:3和如SEQ ID NO:4所示；相應地克隆EYFP的引物 對P3和P4,如如SEQ ID NO :5和如SEQ ID NO :6所示。
[0015]本發明之一種檢測MMP-9功能的FRET生物傳感器在活細胞中檢測MMP-9功能的應 用。
[0016] 本發明之檢測麗P-9功能的FRET生物傳感器將含有特異性MMP-9底物的蛋白加載 至融合有兩種熒光的載體上，由于兩種熒光蛋白相對空間距離較近，因此應用顯微鏡可捕 獲到特定的熒光波長。但當本發明生物傳感器與活性MMP-9蛋白發生分子作用時，活性MMP-9與特異性底物結合，導致兩種熒光蛋白發生空間位移，此時顯微鏡下捕獲的熒光波長發生 改變，由此可以確定活軟骨細胞中分子或蛋白之間的相互作用關系以及觀察MMP-9的病理 作用，而且可以明確活細胞下藥物的作用、活細胞狀態下治療技術的應用等。
[0017] 本發明轉染軟骨細胞，在活細胞工作站上動態觀察ECFP-YFP兩種熒光轉移變化， 也可觀察不同刺激物作用后，軟骨細胞中MMP-9生物傳感器的熒光淬滅過程的動態變化， MMP-9分子的時間、空間變化效應，從而直觀的檢查到MMP-9在軟骨退變中的具體作用。由此 可見，本發明之檢測MMP-9功能的FRET生物傳感器具有操作簡便、結果直觀等特點。
【附圖說明】
[0018] 圖1為構建MMP-9生物傳感器載體主要部分結構示意圖。其中CMV promoter:CMV啟 動子;ECFP:增強表達青色熒光蛋白；Linker: EYFP:黃色熒光蛋白。
[0019] 圖2為MMP-9生物傳感器工作原理圖。
[0020] 圖3 MMP-9生物傳感器（pcDNA3. l( + )-ECFP-MMP9substrate-linker-EYFP)重組子 雙酶切鑒定結果。其中，1:ΜΜΡ-9生物傳感器重組子BamHI和EcoR I雙酶切;M:DNA maker III。
[0021] 圖4為ΜΜΡ9在滑膜細胞中的FRET現象。(A)CFP通道的熒光