電化學側向流動生物測定和生物傳感器的制造方法
【技術領域】
[0001]本發明一般涉及生物測定和生物傳感器，并且特別涉及電化學側向流動生物測定和生物傳感器。
【背景技術】
[0002]在過去幾十年，診斷領域的發展對健康和醫學領域發生的改善具有重要的影響。診斷的進步帶來各種各樣有效且可靠的診斷工具，但診斷工具仍然被認為是昂貴的，即使對于經過培訓的人員來說使用起來也很復雜，并且主要在大型醫療中心存在。因此，全世界對開發新型的和改進的診斷和監測工具和技術有持續需要，該工具和技術同時是便攜式的，可現場操作，并且對病毒和細菌感染以及腫瘤診斷提供快速、準確、直接、定量、低成本的測試。多年來，技術設備的進步已經導致幾種原型生物傳感器的發展，從而能夠實現簡單的、靈敏的、特異性的，和安全的檢測系統。然而，繼續進行生物測定和生物傳感器的研發以帶來新的、更好的方法和設備仍然存在巨大潛力。
[0003 ]生物測定和生物傳感器是基于特定的分析物與任何識別元件，例如抗體、抗原、DNA、酶、生物受體或適體的特異性識別，該識別元件與其特異性DNA底物、抗原或半抗原結合，得到獨有的復合體。抗原通常是高分子量的蛋白質、多糖、脂類和多肽，其可以在不同的免疫測定配置中檢測出。也可以檢測較小的有機分子(半抗原)，比如，藥物、單糖、氨基酸、小肽、磷脂、或甘油三酯，條件是其以化學方法連接至載體蛋白質或其它合成基質。因此，通過免疫系統引起特定抗體產生可以認出幾乎任何分析物。然而，如果適體用于檢測，而不是抗體的“非三明治”型試驗，則小分子(半抗原)不需要結合至載體蛋白質或其它合成基質。
[0004]最近，多類生物檢測已應用于臨床診斷、環境分析和食品安全評估。其中大多數涉及合成的結合物，該結合物包括放射性的、酶的、熒光的、化學發光的或肉眼可見的金屬溶膠標簽，以及特別設計的反應室，比如微孔板。盡管這些試驗是定量的，比如ELISA，所遵循的協議長并且可能需要花費時間和許多反應步驟完成。其成本相對較高并且程序繁瑣，需要昂貴的儀器和訓練有素的人員。
[0005]在另一方面，側向流動免疫測定，也被稱為“條帶”測試，是幾乎任何人能夠簡單進行，且比傳統的實驗室為基礎的任何試驗更迅速地產生結果的廣泛測試。可以花費少至幾分鐘使該條帶上的有色線顯影。近年來，此診斷方面顯著發展，并且最常見和公知是家庭妊娠測試。側向流動免疫分析擁有很大的診斷優勢，事實上，它便宜、操作簡單、快速(只需幾分鐘)，且便于攜帶。它通常需要很少或不需要樣本或試劑制備。該條帶非常持久和穩定、保質期長，且通常不需要冷藏。該技術具有廣泛的醫療診斷應用，例如，確定懷孕，內臟器官衰竭(例如，心臟發作、腎衰竭或糖尿病)，特定病原體感染或污染。在一些情況下，可以利用該條帶測試通過分析血液流中的腫瘤特異性標記物(典型地，特異性抗體)快速檢測疾病，比如癌癥。
[0006]側向流動免疫測定的原理依賴于競爭在聚合物或金屬微粒上的結合位點。由特異性目標激起的抗體結合到金屬納米顆粒或染色的聚合物顆粒。接著，使用免疫過程將這些顆粒應用于釋放墊上以便產生穩定的顆粒儲層，釋放在基于硝化纖維的膜上。將兩行試劑固定在膜上。目標參考物或測試行包括可以特異地結合待識別的目標和其他的結合物，對照為抗抗目標抗體行。釋放墊和膜與吸收墊組裝在一起。首先，將樣本加入吸收墊中，然后將條帶擱置幾分鐘，并且直接用肉眼讀取結果，尋找有色行的存在。制造這些試劑盒相對便宜。該試劑盒還具有較長的保質期并且完全是一次性的。因此，該技術理想地適合任何快速診斷。
[0007]側向流動免疫測定
R.Wilson (2008)在“The use of gold nanoparticles in diagnostics anddetect1n”，Chemical Society Reviews 37(9): 2028-2045 中評述了在最普通的形式中，側向流動免疫測定由白色多孔膜組成，該白色多孔膜使抗體或抗原行帶有條紋，并且與結合至肉眼可見的標記的抗體相互作用。首先參考圖1，其展示了現有技術的條帶。應該注意，圖1涉及現有技術的知識，并且，其僅僅構成參考，以更好地理解本發明。
[0008]根據圖1，側向流動設備(條帶)的設計展示了該條帶的四個主要部件(樣本墊、結合墊、硝酸纖維素膜和吸液芯XTL和CL分別代表測試行和對照行。含有目標分析物分子或實體的流體樣本應用于條帶的最近端，即，坐落在結合墊的頂部上的樣本墊或吸附墊。結合墊含有用抗體涂布的比色金屬納米顆粒，比如，金納米顆粒(GNP)或聚合物(例如，膠乳)微球，該抗體對目標分析物分子(抗原)具有特異性。樣本通過毛細作用經由硝酸纖維素膜迀移。
[0009]疏水硝酸纖維素膜充當基底(固體支撐體)，抗目標分析物抗體固定于底層上，在膜的特定區域中橫跨該膜的帶中，在該位置，抗目標分析物抗體捕捉該分析物并且結合物作為后者進行迀移。側向流動免疫測定中必不可少的是流體樣本，或含有感興趣的分析物的提取物迀移通過已經固定了結合分子的條帶的不同區域，該結合分子與分析物產生或多或少的特異性的相互作用。
[0010]如圖1所示，在該條帶上鋪設至少兩行:測試行(TL)和對照行(CL)，該至少兩行都已經用特異性抗體或抗原進行預處理，并且是商用側向流動條帶的標準。對照行可以包括抗原或抗體，該抗原或抗體對結合的抗體具有特異性。通常，TL結合分析物，而CL結合連接至紅色，涂布納米金顆粒的捕獲抗體或抗原。這些行通常更靠近吸液芯墊而遠離結合墊，以便提高側向流動免疫測定的整體性能。一些側向流動試驗可具有一條以上的測試行，但附加的每條測試行大大增加了免疫傳感器的復雜性，因此，增加了成本。
[0011]在流體樣本吸附到樣本墊上之后，流體通過毛細作用移動到結合墊中，使標記的結合物顆粒再水合并且允許這些顆粒與所吸附的流體樣本混合。標記的結合物與樣本中含有的特異性的分析物相互作用，從而引發分子間的相互作用，分子間的相互作用取決于試劑的親和力和親合力。然后，標記的結合物開始向測試行迀移，從而捕捉并識別結合的分析物，在該測試行標記的結合物被固定并且產生不同的信號，例如，以有色行的形式，表明該測試是陽性的。過量的試劑移過捕獲行和被截留在吸液芯墊中，該吸液芯墊被設計成通過毛細作用抽取穿過膜的樣本，從而保持沿所述層析條帶的側向流動。
[0012]盡管側向流動條帶立即取得成功，但其目前的應用留下許多有待改進的地方。在對照行的不同信號可能指示體液適當流過該條帶。取決于樣本中存在的分析物和進行的免疫測定的類型，在測試行和對照行，或，可替換地，僅在測試行結合有色試劑。因此，結果被解讀為在反應基質上存在或不存在捕獲的結合物行，并且通過眼睛或使用閱讀器讀取。不幸地，這些結果是二元的(“是或否”)，并且不提供樣本中存在的分析物的任何定量測量。換句話說，側向流動設備的主要缺點是，其僅能夠產生定性或半定量測量，同時只能使用特殊的和另外的儀器，比如，比色計，獲得定量選項。
[0013]此外，側向流動條帶受到大量的假陽性結果的困擾。一些側向流動免疫測定是競爭性試驗，其與抗體夾心免疫測定的區別在于結合墊包含已經結合至目標分析物的抗體。如果目標分析物存在于樣本中，則其不能與結合物產生復合體，因此，仍然是未標記的。競爭性免疫測定最適合測試小分子，比如，毒素和激素，且不能同時結合一個以上的抗體。例如，如果不存在過量的未標記分析物，檢測線中可能出現些微有色行，指示不確定的結果。
[0014]側向流動免疫測定不能提供定量結果已經促進對這樣的新的生物測定和生物傳感器的迫切需求:允許在相同的樣本內進行定量測量并且使當前側向流動條帶的框架小型化，同時維持快速診斷、長保質期并且使未經訓練的人員易于操作。由于側向流動免疫測定試劑盒和設備的市值估計約為21十億美元，并且全世界超過200家公司產生了一定范圍的測試形式，已經進行了許多嘗試以改進這些裝置。因此，對定量的、更敏感的，且不顯示假陽性結果的新類型的側向流動試驗的研發具有長期需求。
[0015]因此，本發明的目的是解決與現代側向流動試驗和生物傳感器相關聯的問題，并在相同的平臺內進行定量測量。本發明通過將側向流動技術和電化學方法成功結合在一個試驗中和在單個設備中解決這些問題。如下文所述，電化學方法與側向流動技術的這種集成，產生了用于生物傳感器的定量的、快速的和便攜式的新型平臺。
[0016]1.0jeda 等人(2012),在 “Electrochemical immunosensor for rapid andsensitive determinat1n of estrad1l”， Analytica Chimica Acta 743: 117-124中描述了基于用嫁接的對-氨基苯甲酸對絲網印刷碳電極進行表面修飾，接著共價結合鏈霉親和素且固定生物素化抗雌二醇(抗雌二醇生物素)，制備用于雌二醇的電化學免疫傳感器。
[0017]US 6，478，938提供一種電化學膜條帶生物傳感器，該生物傳感器結合免疫層析法和電導檢測技術。所述生物傳感器使用納米金顆粒測量金屬的導電性。金屬膠體在電化學信號發生膜墊中產生定量信號。因此，該生物傳感器的分析信號是基于納米金顆粒的金屬導電性。
[0018]US 7，300，802涉及一種生物傳感器，該生物傳感器包括具有上文所述的四個膜墊的常規膜帶層析試驗系統和供應用于酶的底物溶液的另外的膜。此外，該條帶具有兩組橫向設置的膜墊，并且包括用于吸附豎直流動介質的墊和用于吸附水平流動介質的墊。該生物傳感器展示了用于免疫反應和酶促反應的連續的側向流動過程，并該生物傳感器使用HRP酶，以提供分析信號。這是復雜的多步驟測試，其包括免疫檢測以及酶促反應，結果是通過絲網印刷電極測定電化學信號。
[0019]US 2004/0106190公開了用于檢測測試樣本中殘留的分析物的存在或其數量的流通型試驗設備。該設備包括流體介質，該流體介質與電化學親合型生物傳感器連通。電化學親合型生物傳感器利用檢測和校準工作電極，該電極能夠產生可測量的檢測電流且與親和試劑，比如氧化還原介質和捕獲配體，連通。通過用校準電流校準檢測電流確定測試樣本內分析物的量。該傳感器使用氧化還原酶提供電化學信號。
[0020]Dan Du 等人(201 2 )在 “Integrated Lateral Flow Test Strip withElectrochemical Sensor for Quantificat1n of Phosphorylated Cholinesterase:B1marker of Exposure to Organophosphorus Agents”， Analytical Chem.84: 1380-1385中描述了具有電化學傳感器設備的集成的側向流動免疫測定條帶，該電化學傳感器設備用于量化對農藥(有機磷)和神經毒劑的暴露。該生物傳感器是基于抗體的使用以選擇性地捕獲酶用于進行酶活性試驗。連接至便攜式電化學分析儀的測試條帶用于免疫反應和選擇性分離酶和生物樣本。該生物傳感器測量酶(包括受抑制的和活化的)的總量。
[0021]本發明的新生物傳感器(ELFB-電化學側向流動生物傳感器)具有全新的設計，并且可以很容易地應用于各種生物系統