梅毒螺旋體IgM抗體Dot-ELISA檢測方法
【技術領域】
[0001 ]本發明涉及梅毒特異性I gM抗體的檢測，尤其是涉及梅毒螺旋體I gM抗體Do t -ELI SA檢測方法。
【背景技術】
[0002]梅毒是由梅毒螺旋體引起的性傳播性疾病，近年來在國內的發病率居高不下，梅毒的防控已成為我國公共衛生服務的主要任務之一。
[0003]梅毒的實驗室診斷方法主要有如下幾種([I]林麗蓉，楊波，潘錫濤，等.潛在的血源傳播患者梅毒血清學檢測方法的選擇.中華醫院感染學雜志.2010，20(10):1491-1494):
[0004](I)病原學檢測:梅毒螺旋體感染早期，當梅毒抗體還未產生或含量較低時，暗視野顯微鏡查找螺旋體成為最早的實驗室診斷方法，但易受取材技術、取材部位、樣本中梅毒螺旋體含量、局部用藥及送檢時間等諸多因素影響，靈敏度較低。
[0005](2)抗體檢測試驗:梅毒螺旋體不能進行體外培養，診斷主要依賴于實驗室檢查，現有的血清學檢測靈敏度、特異性不高，任何一種檢測方法均存在缺陷，臨床漏診和誤診率較高。
[0006]用于梅毒血清學檢驗的抗原主要以重組抗原了?附5、了?附7、了?吧7、了?財4.5、了?財7^^([2]Lin,L.R.,Z.G.Fu,et al, Development of a colloidal go I d-1mmunochromatography assay to detect immunoglobulin G antibodies to Treponemapallidum with TPNl7 and TPN47 ,Diagnostic microb1logy and infect1usdisease.2010.68(3): 193-200.)，檢測方法包括生物素親和素檢測法(中國專利CN201410410641.4)、熒光梅毒螺旋體抗體吸收試驗等方法，這些檢測方法的結果判斷需要特殊的儀器設備(前者需要酶標儀而后者不僅需要熒光顯微鏡還需要有經驗豐富的技術人員進行結果判讀，因此在基層或邊遠地區，急需一種靈敏度和特異性較高的梅毒螺旋體特異性抗體檢測方法。
【發明內容】
[0007]本發明的目的在于提供不需要特殊儀器，可實現大規模的篩查，應用范圍廣，實用性強的梅毒螺旋體IgM抗體Dot-ELISA檢測方法。
[0008]所述梅毒螺旋體特異性IgM抗體的dot-ELISA檢測方法，包括如下步驟:
[0009]I)采用基因克隆技術，PCR擴增編碼梅毒螺旋體抗原的DNA，并插入大腸桿菌中使其表達，得梅毒螺旋體特異性重組抗原TPNl 7和TPN47。
[0010]2)在硝酸纖維素的光滑面上壓跡成圓形小孔，作為點樣部位；用微量取液器取0.5yL抗原混合物，加至硝酸纖維素膜上的壓跡中央，干燥;將點樣后的的硝酸纖維素膜片浸于奶粉中封閉；將封閉后之硝酸纖維素膜置于磷酸鹽緩沖液中漂洗，得重組抗原包被的硝酸纖維素膜，簡稱快診膜，存放于陰晾干燥處備用；
[0011 ] 3)以人μ鏈為抗原免疫Balb/c小鼠，通過雜交瘤技術，篩選獲得雜交瘤細胞株，穩定分泌抗人μ鏈單克隆抗體；
[0012]4)采用過碘酸鈉法進行抗人μ鏈單克隆抗體的辣根過氧化物酶(HRP)標記；
[0013]5)將步驟2)得到的重組抗原包被的硝酸纖維素膜沿壓跡或劃痕剪下，光滑面向上置于的聚苯乙稀微量反應板孔中，每孔中加入待檢樣品50yL，37°C孵育1min;
[0014]6)將硝酸纖維素膜用磷酸鹽緩沖液洗滌，洗滌后棄液體；
[0015]7)加入50yL步驟4)中辣根過氧化物標記的抗人μ鏈單克隆抗體，37°C孵育1min;
[0016]8)用磷酸鹽緩沖液洗滌，洗滌后棄液體；
[0017]9)加入顯色劑，37°C放置5min后，再加入磷酸鹽緩沖液洗滌液漂洗，棄液體；
[0018]10)結果判讀，硝酸纖維素膜上斑點呈棕色陽性，無色為陰性。
[0019]在步驟2)中，所述在硝酸纖維素的光滑面上壓跡成圓形小孔可采用直徑6mm的圓形打孔器在硝酸纖維素的光滑面上壓跡成圓形小孔;所述奶粉可采用質量百分濃度為5%的脫脂奶粉;所述封閉的時間可為30min;所述磷酸鹽緩沖液可采用摩爾濃度為0.0lmmol/L，pH為7.4的磷酸鹽緩沖液;所述漂洗可漂洗3次，每次2min。
[0020]在步驟6)中，所述磷酸鹽緩沖液可采用350yL摩爾濃度為0.0lmmol/L，pH為7.4的磷酸鹽緩沖液;所述洗滌可洗滌3次，每次2min。
[0021 ] 在步驟8)中，所述磷酸鹽緩沖液可采用350yL摩爾濃度為0.0lmmol/L，pH為7.4的磷酸鹽緩沖液;所述洗滌可洗滌3次，每次2min。
[0022]在步驟9)中，所述顯色劑可采用3，3_ 二氨基苯聯胺(DAB);顯色劑的加入量可為50yL ；所述3 , 3-二氨基苯聯胺(DAB)可按50mg 3 ,3-二氨基苯聯胺加入摩爾比0.05mol/L的Tris-Hcl緩沖生理鹽水10ml配制；所述磷酸鹽緩沖液可采用350yL摩爾濃度為0.0lmmol/L，pH為7.4的磷酸鹽緩沖液。
[0023]本發明的重組抗原包被的硝酸纖維素膜，作為一種抗原的干燥保存形式，延長已包被抗原的保存時間，可實現單個樣本獨立保存，避免反復凍融造成的抗原變性;本發明應用斑點酶聯免疫吸附法(dot enzyme-linked immunosorbentassay，dot_ELISA)檢測梅毒特異性IgM抗體不需要特殊儀器，也可實現大規模的篩查，其應用范圍廣，實用性強。
【附圖說明】
[0024]圖1為硝酸纖維素膜壓跡示意圖。
[0025]在圖1中，各標記為:1、硝酸纖維素膜，2、硝酸纖維素膜壓跡。
【具體實施方式】
[0026]以下實施例將結合附圖對本發明作進一步的說明。
[0027]實施例一
[0028]參見圖1，所述的梅毒螺旋體特異性IgM抗體的do t-ELI SA檢測方法，包括如下步驟:
[0029](I)制備梅毒螺旋體特異性重組抗原:
[0030]采用基因克隆技術，PCR擴增編碼梅毒螺旋體抗原的DNA，并插入大腸桿菌中使其表達，得梅毒螺旋體特異性重組抗原TPNl 7和TPN47。
[0031](2)制備重組抗原包被的硝酸纖維素膜:
[0032]用直徑6mm的的圓形打孔器在硝酸纖維素的光滑面上壓跡成圓形小孔，作為點樣部位;用微量取液器取0.5yL抗原混合物，加至硝酸纖維素膜上的壓跡中央，室溫下干燥;將點樣后的的硝酸纖維素膜片浸于5%的脫脂奶粉中，室溫下封閉30min;將封閉后之硝酸纖維素膜置于0.0lmmol/L pH7.4磷酸鹽緩沖液中漂洗3次，每次2min。取出后將硝酸纖維素膜片置室溫晾干即為“快診膜”，存放于陰晾干燥處備用。
[0033](3)制備抗人γ鏈單克隆抗體
[0034]以人γ鏈為抗原免疫Balb/c小鼠，通過雜交瘤技術，篩選獲得雜交瘤細胞株，穩定分泌抗人γ鏈單克隆抗體；
[0035 ] (4)抗人μ鏈單克隆抗體的辣根過氧化物酶(HRP)標記
[0036]采用過碘酸鈉法進行辣根過氧化物酶(HRP)標記；
[0037](5)檢測標本處理:
[0038]取人靜脈血5mL，置37°C水浴30min，3000g離心lOmin，上清為檢測樣品備用。
[0039](6)加樣:
[0040]將步驟(2)中的快診膜沿壓跡或劃痕剪下，光滑面向上置于的聚苯乙烯微量反應板孔中，每孔中加入待檢樣品50yL，37°C孵育lOmin。
[0041](7)硝酸纖維素膜洗滌:
[0042]加350yL 0.0lmmol/L pH7.4磷酸鹽緩沖液充分洗滌3次，每次2min，每次洗滌后棄液體。
[0043](8)加入50yL步驟(4)中辣根過氧化物標記的抗人μ鏈單克隆抗體，37°C孵育1min0
[0044](9)350yL 0.0lmmol/L pH7.4磷酸鹽緩沖液充分洗滌3次，每次2min，每次洗滌后棄液體。
[0045](10)顯色:加入3，3-二氨基苯聯胺(DAB)顯色劑50yL，37°C放置5min，所述的DAB顯色劑按50mg DAB加入0.05m