一種用于快速檢測淋巴細胞表面分子cd45分布的試劑盒的制作方法
【專利說明】一種用于快速檢測淋巴細胞表面分子CD45分布的試劑盒
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技術領域
[0002]本發明屬于生物技術領域，涉及細胞表面分子的觀察技術，尤其涉及一種用于快速檢測淋巴細胞表面分子CD45分布的試劑盒。
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【背景技術】
[0004]植物凝集素是一類具高度特異的糖結合活性的蛋白，其最大的特點在于識別糖蛋白和糖脂，特別是細胞膜中復雜結構的糖鏈:即細胞膜表面決定簇。植物凝集素能與動物、植物、微生物細胞發生特異的作用，引起或增強細胞內吞作用或細胞間轉運，誘發一定的生理效應。它可以儲存物質;抵御細菌、真菌、病毒等病原體的入侵;還作為促有絲分裂因子，調節細胞的分裂和生長。由于凝集素能選擇性地識別細胞膜糖脂或糖蛋白糖鏈的不同糖基，在生化、醫學上，植物凝集素常用于細胞的分型、分離、糖蛋白和有絲分裂原的純化、癌化學的研究等。隨著基因工程的發展，植物凝集素已成為一種很有潛力對抗疾病的工具，在免疫學、腫瘤、生物學等方面得到諸多應用。紅桂木凝集素(Artocarpus LingnanensisLectin，ALL)是我們的相關研究人員對30多種生長在廣西東南部地區的植物種子經過精心篩選出來的植物凝集素，前期研究表明它特異識別可特異性結合D-半乳糖和α-乙酰氨基半乳糖，并具有很強的促進T淋巴細胞增殖活性。通過進一步深入機制的研究，我們發現ALL是通過與T淋巴細胞表面分子⑶45胞外區段Gall-3GalNAc的相互作用而誘導T細胞的活化和增殖(文章待發表)。
[0005]CD45由一類結構相似，分子量較大的跨膜蛋白組成，廣泛存在于白細胞表面，其胞漿區段具有蛋白質酷氨酸磷酸酶活性，通過脫磷酸作用激活Src激酶，進而激活Fyn、Hck、Lck和Lyn，導致⑶3、ZAP-70和Cbl的活化，最終活化MAPK信號轉導通路，從而調節細胞因子的合成和分泌。因此CD45是細胞膜上信號傳導的關鍵分子，在淋巴細胞的發育成熟，功能調節中具有重要作用。此外CD45在細胞表面存在與否可作為某些T細胞亞群的分類標志。
[0006]目前CD45分子的檢測依靠CD45抗體，但抗體試劑非常昂貴，為解決這一問題，我們利用紅桂木凝集素與特定糖基的特異性結合特點，成功檢測到淋巴細胞表面的CD45分子。經檢索，紅桂木凝集素用于檢測⑶45分子未見報道。
[0007]
【發明內容】
[0008]本發明的目的是為克服已有淋巴細胞表面分子CD45的檢測技術的不足，提供一種用于快速檢測淋巴細胞表面分子CD45分布的試劑盒，利用紅桂木凝集素探針，該熒光探針可以快速、準確的得到診斷結果，且檢測成本低。
[0009]本發明是這樣實現的:
一種用于快速檢測淋巴細胞表面分子CD45分布的試劑盒，試劑盒包括: 1)紅桂木凝集素探針；
2)DAPI(lmg/ml)；
3)0.1%TritonX-1OO；
4)4%多聚甲醛；
5)0.0lMPBS；
6 )50%甘油。
[0010]以上所述的紅桂木凝集素探針采用熒光染料標記。
[0011 ]以上所述的熒光染料選自異硫氰酸熒光素。
[0012]以上所述的紅桂木凝集素探針濃度為lOyg/ml。
[0013]本發明的優點和積極效果:
1.本發明的試劑盒在紅桂木凝集素分離純化中，與已有技術使用的3000rpm離心15或20min不同，本次的離心條件為4°C，5000rpm離心lOmin。在低溫離心機中，離心速度的加大可使沉淀更快更徹底。
[0014]2.本發明的試劑盒在制備ALL-FITC中，與已有技術使用的Sepharose 4B不同，本次所用的瓊脂糖凝膠為Sepharose 6B0Sepharose 6B更適合紅桂木凝集素的分離。
[0015]3.本發明的試劑盒所染色的淋巴細胞不受種屬限制，可以是人的淋巴細胞，也可以是其他物種的淋巴細胞；
4.本發明的試劑盒所染色的淋巴細胞不受種類限制，可以是T淋巴細胞，也可以B淋巴細胞或NK細胞。
[0016]5.本發明的試劑盒染色結果，既可用激光共聚焦顯微鏡觀察，看到染成藍色的細胞核和染成綠色的細胞膜表面分子CD45;還可以用流式細胞儀分析細胞膜表面分子CD45的含量。
[0017]6.本發明的試劑盒，能夠準確快速地檢測到淋巴細胞表面分子CD45的分布或含量，具有較高的特異性和靈敏度，不需要抗體，結果清晰，經濟、方便，而且檢測對象淋巴細胞不受種屬和種類的限制，具有較好的應用前景。
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【附圖說明】
[0019]圖1:淋巴細胞表面ALL與⑶45共定位；
DAPI:即4’，6-二脒基-2-苯基卩引噪(4’ ,6-diamidino-2-pheny I indole)，是一種染細胞核的藍色熒光染料；
FITC-ALL:偶聯異硫氰酸焚光素(Fluorescein isoth1cyanate)的紅桂木凝集素，呈綠色熒光；
PE-OM5:偶聯Phycoerythrin的⑶45抗體，呈紅色焚光；
Merge:兩種顏色的的疊加，呈橙黃色。
[0020]圖2:ALL_FITC與PE-CD45雙染淋巴細胞后的流式分析圖；
FITC-ALL:偶聯異硫氰酸焚光素(Fluorescein isoth1cyanate)的紅桂木凝集素。[0021 ] PE-CD45:偶聯 Phycoerythr in 的CD45 抗體。
[0022]圖3:CD45抗體抑制ALL與淋巴細胞結合的流式分析圖； FITC-ALL:偶聯異硫氰酸焚光素(Fluorescein isoth1cyanate)的紅桂木凝集素；右邊的曲線Ant1-CD45 antibody:無抗CD45抗體時，ALL與淋巴細胞的結合情況圖；左邊的曲線:+ Ant1-CD45 antibody:當加入抗CD45抗體后，曲線往左移，表明ALL與淋巴細胞的結合能力下降。
[0023]圖4:GalNAc抑制ALL與淋巴細胞的結合；
ALL binding:紅桂木凝集素與淋巴細胞的結合能力；
左邊的曲線:FITC-Control:異硫氰酸熒光素對照；
右邊的曲線:FITC-ALL:偶聯異硫氰酸焚光素(Fluorescein isoth1cyanate)的紅桂木凝集素，反映ALL與淋巴細胞的結合情況；
中間的曲線:GalNac + FITC-ALL:反映加入N乙酰氨基半乳糖后，ALL與淋巴細胞的結合能力下降。
[0024]圖5:淋巴細胞膜蛋白染色結果圖；
A為:淋巴細胞膜蛋白經ALL- agarose柱后，收集到的ALL受體蛋白經聚丙烯酰氨凝膠電泳后考馬斯亮藍染色圖譜；
B為:淋巴細胞表面蛋白經ALL- agarose柱后，收集到的ALL受體蛋白經聚丙稀酰氨凝膠電泳后進行凝集素印跡分析的圖譜；
C為:淋巴細胞表面蛋白經ALL- agarose柱后，收集到的ALL受體蛋白經聚丙稀酰氨凝膠電泳后用抗CD45抗體進行免疫印跡分析的圖譜。
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【具體實施方式】
[0026]下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規方法。
[0027]下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業途徑得到。
[0028]下述中的取血均經過供血者同意。
[0029]實施例1紅桂木凝集素的獲得
紅桂木凝集素的分離純化的所有操作，均在4°C下進行。方法是:先取紅桂木種子30g，粉碎研磨，按1: 5的比例加入0.0 Imo 1/L含0.1moI/L NaCl，pH7.2的磷酸鹽(I3BS)緩沖溶液150mL，浸泡抽提24h ；將抽提液過濾，濾液以5000rpm離心1min，過濾，于上清液中加入硫酸銨至30%飽和度；再以5000rpm離心1min，過濾，將上清液加入硫酸銨至60%飽和度，放置12h;以5000rpm離心1min，棄上清液