一種快速檢測副溶血性弧菌的方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及微生物檢測領域，具體采用Fe304/RU(bqy)32+納米微球集成免疫磁珠捕獲技術和免疫層析快速檢測副溶血性弧菌。
技術背景
[0002]副溶血性弧菌是常見的食源性致病菌之一，該菌主要來源于蝦、魚和貝類等海產品。據國家食源性疾病監測網報告，至1998年以來我國由副溶血性弧菌引起的食物中毒呈上升趨勢，且超過沙門菌食物中毒而躍居首位，成為最嚴重的食源性病原菌。人類食用該菌感染的海產品可引發腸胃炎和敗血癥等腸胃疾病，是我國部分沿海地區的食物中毒案例中的首要病原菌。
[0003]自1950年發現副溶血性弧菌至今，國內外檢測該菌的方法仍以常規分離培養法為主。該法操作復雜、檢測周期長(4-7d)，已不能適應衛生應急檢測的需要;ELISA法、PCR方法以及生物傳感器法對副溶血性弧菌檢測靈敏度高，然而它們需要較長的檢測時間、昂貴的儀器以及專業的技術人員。因此它是必須的建立快速、靈敏的檢測方法。
[0004]膠體金免疫層析試紙條以其操作簡單、快速(10-15min)、準確等特點成為基層篩選的重要工具，然而由于膠體金的光學信號有限，膠體金免疫層析試紙條的靈敏度不高，對副溶血性弧菌的檢測限通常不高于105CFU/mL，這個缺陷限制了其在食品和農產品檢測中的應用。因此，提高試紙條的靈敏度將為副溶血性弧菌的檢測提供簡單、高效的途徑。
【發明內容】
[0005]本發明目的在于提供一種快速、靈敏、簡便的副溶血性弧菌定性、定量檢測技術。
[0006]本發明具體方案如下:
[0007]—種快速檢測副溶血性弧菌的方法，包括以下步驟:
[0008]I)納米微球的制備:
[0009]a.添加0.4-0.8mmolFeCl3.6H2O和0.2-1.6mmol FeCl2.4Η20到10mL的去離子水中，向溶液中通入氮氣并加熱到80-120°C，然后將3-7mL 25%的NH3.H2O添加到混合液中，反應2h ；用永磁鐵從反應溶液中分離出黑色的固體物質用高純水清洗3?5次，得Fe3O4納米粒子；
[0010]b.取12mg Fe3O4納米粒子用1-1OmL去離子水和20mL乙醇的混合液重懸，先在緩慢攪拌的條件下加入0.3-0.9mL的NH4OH溶液，再將10-300uL正硅酸乙酯溶解在50uL乙醇溶液中逐滴加入，室溫下反應12h，在Fe3O4納米粒子表面形成一層二氧化硅，用去離子水溶液清洗幾次，在乙醇溶液中復溶得到二氧化硅包覆的Fe3O4納米粒子；
[0011 ] c.把10_300uL的正娃酸乙酯，20mL無水乙醇，1-1OmL去離子水和ImL 0.5_3mg/L的啡口羅啉聯舒(1?11(^卩7)32+)混合，將混合溶液加入0.511^二氧化娃包覆的？6304納米粒子，最后加入600-900yL的NH4OH,劇烈攪拌3h，得到Fe304/Ru(bqy)32+納米微球，用去離子水清洗備用；
[0012]d.將ImL的巰丙基三甲氧基硅烷添加到1mL的乙醇溶液中，用該混合物復溶Fe3O4/Ru(bqy)32+納米微球，在常溫下300rpm攪拌12h后，再80°C 300rpm攪拌Ih，離心得到娃燒化的 Fe304/Ru(bqy)32+納米微球；
[0013]e.將硅烷化的Fe304/Ru(bqy)32+納米微球添加到包含0.06g NaHCO3，0.08g十二烷基苯磺酸鈉，0.05mL苯乙烯，0.15mL丙烯酸和0.5g過硫酸鉀溶液的50mL的水溶液，水浴70°C，200r/min下攪拌，反應5h后得羧基化的Fe304/Ru(bqy)32+納米微球；
[0014]2)取0.5_2mg羧基化的Fe304/Ru(bqy)32+納米微球加入ImL偶聯緩沖液中，調節pH至5-10，加入0.05-0.18mg 1_(3_ 二甲氨基丙基)_3_乙基碳二亞胺鹽酸鹽(EDC)活化羧基，及50-300yg抗副溶血性弧菌單抗，在溫度37°C時，放在10-15rpm的旋轉儀上偶聯60-120min，磁分離3-5min，棄上清；用清洗緩沖液沖洗3-5遍之后，取ImL封閉劑與納米微球混合封閉
0.5_lh，得到 Fe304/Ru(bqy)32+納米微球-單抗;
[0015]所述偶聯緩沖液配制方法如下:將3mL 19.07g/mL的硼砂與7mL 12.37g/mL的硼酸混合后，稀釋10倍體積；
[0016]所述清洗緩沖液配制方法如下:稱取0.43g 2-(N-嗎啡啉)乙磺酸(MES)溶于200mL的無菌蒸餾水中，調pH為5.5-6.0；
[0017]所述封閉劑配制方法如下:取10mg牛血清白蛋白(BSA)加入ImL磷酸鹽(PBS)緩沖液配成封閉劑；
[0018]3)培養副溶血性弧菌，將菌液調整濃度為106CFU/mL、105CFU/mL、104CFU/mL、103CFU/mL，各取ImL備用；取待測樣品溶液lmL、各濃度菌液lmL，分別與100-150yg Fe304/Ru(bqy)32+納米微球-單抗，于溫度37°C，旋轉儀轉速10-15rpm混合孵育30-60min，孵育后磁分離3_5min后，棄上清，用PBS緩沖液清洗后，復溶于PBS中得Fe304/Ru(bqy)32+納米微球-單抗-菌；
[0019]4)免疫層析試紙條的制備:將樣本墊用pH 8.50.1M Tris-HCl緩沖液(I %BSA，0.5 %TWeen-20)浸泡處理，置于60°C鼓風干燥箱，2h后取出備用;將副溶血性弧菌兔多抗和驢抗鼠二抗噴到硝酸纖維膜上分別作為檢測線(T線)和質控線(C線)，濃度均為l-2mg/mL，噴量均為0.75uL/cm，37°C真空干燥過夜取出置于干燥缸中備用;將過濾墊、樣本墊、硝酸纖維膜、吸水紙依次粘貼在PVC底板上，貼好后將其切成4mm寬的試紙條，裝卡;將制備好的試紙條裝入鋁箔袋中，加干燥劑密封，置于干燥缸中保存備用；
[0020]5)試紙條對樣品的檢測:將收集到的Fe304/Ru(bqy)32+納米微球-單抗-菌稀釋到50-150yg/mL，取10yL滴加到試紙條加樣孔中，10-15min后，用熒光讀取儀記錄T線、C線熒光強度和T/C的值；
[0021]6)定性分析:用肉眼觀察結果進行定性分析，T線顯色則說明樣品中有副溶血性弧菌，T線不顯色則說明樣品中沒有副溶血性弧菌或是含有副溶血性弧菌的量低于13CFU/mL；
[0022]7)定量分析:使用熒光讀取儀測量T線、C線的熒光強度，以及T/C值，以不同菌的濃度為橫坐標，T/C值為縱坐標繪制標準曲線，確定普通樣品中的副溶血性弧菌數量。
[0023]所述步驟l)Fe304/Ru(bqy)32+納米微球粒徑為80_210nm;
[0024]步驟3)所述免疫層析試紙條是在粘性底板上依次粘貼濾紙、樣本墊、硝酸纖維膜、吸水紙組成。使用副溶血性弧菌Fe304/RU(bqy)32+納米微球免疫層析試紙條，同時使用熒光讀取儀定量檢測的方法，其特征在于:配制已知系列濃度的副溶血性弧菌溶液，用熒光讀取儀測出其對應的熒光強度，根據這一系列數值與對應濃度建立標準曲線，然后將檢測樣品的試紙條放入熒光讀取儀中，根據熒光讀取儀輸出的數值，查標準曲線圖即可得出樣本中副溶血性弧菌的含量。
[0025]本發明有以下優點:
[0026]I)本發明具有操作簡單、檢測時間短(10-15min)等優點，適于進行現場檢測；
[0027]2)本發明技術方案檢測穩定性好，檢測靈敏度高，檢測限能達到103CFU/mL。采用的Fe304/Ru(bqy)32+納米微球，不僅具有磁性納米粒子的超順磁性能，對樣品進行濃縮富集，而且具有Ru(bqy)32+納米微球強的光學信號、Ru(bqy)32+納米微球表面高效偶聯抗體的性能，從而提高了試紙條的檢測靈敏度。
[0028]3)本發明無需將副溶血性弧菌從免疫磁珠上洗脫下來的步驟，提高了捕獲效率；免去了將免疫標記物噴在結合墊上的步驟，免疫學反應更加均一，定量檢測時變異系數小；減少了工作量和雜菌污染概率。
[0029]4)能同時對目標物副溶血性弧菌進行定性及定量檢測。
[°03°] 5)本發明的標記物為羧基化的Fe304/Ru(bqy)32+納米微球，該標記物主要通過化學偶聯的方式標記抗體，相比傳統膠體金(物理吸附作用)，能夠捕獲更多抗體，從而提高檢測靈敏度，另外，該標記物羧基修飾的穩定結構能提高材料的穩定性，提高保存期為I年，傳統膠體金保存期為6個月。
[0031 ] 6)本發明的Fe304/Ru(bqy)32+納米微球由于核內Fe3(k納米粒子的作用，能更好的防止殼內熒光染料Ru (bqy) 32+的泄漏，