;脈沖離子提取時間：30ns ;線性正離子檢測 方式;質量范圍m/z值:1000Da-20000Da;激光頻率:60.0Hz;激光能量:35 %左右。
[0086] (2)質量校正
[0087]當利用FlexControl軟件對樣品進行采集圖譜前，需使用校正標準樣品Peptide Calibration Standard和Protein Calibration Standard I混合液進行自動或手工校正， 其m/z值見表2。
[0088] 表2校正標準物質對應的質荷比范圍
[0089]
[0090] 5 ·圖譜分析
[0091] (1)圖譜的調基
[0092] MALDI TOF MS帶有flexanalysis專業技術軟件，在此軟件中打開需要分析的圖 譜，點擊工具欄process,選擇subtract mass spectrum baseline。調基目的是使基線降 低，比較直觀。
[0093] (2)圖譜的標峰
[0094] 調基之后的圖譜，點擊工具欄Method，點擊open，選擇proteins l_20kDa fullprocess .FAMSMethod,點擊工具欄Mass List選擇find。
[0095]對其他圖譜同樣標峰，可以通過copy已標峰圖譜，然后選定待標峰圖譜paste special，選擇method，后點擊工具欄Mass List選擇find。標峰的目的是使主要信號峰的m/ z值顯示，比較直觀。
[0096]三、蛋白質指紋圖譜模型的建立
[0097]利用MALDI TOF MS自帶的Biotyper專業技術軟件，對22株唐菖蒲伯克霍爾徳氏菌 菌株的蛋白質圖譜進行分析，獲得22株菌株的特異性識別圖譜。部分結果如圖5-9所述，其 對應的質荷比檢測值見表3。圖5-9中1.3050、1.3360、1.2892、1.3824分別表示菌株編號為 1.3050、1.3360、1.2892、1.3824的菌株的檢測結果圖，其中帶下劃線的數字表示共同特有 峰對應的質荷比值。
[0098] 表3唐菖蒲伯克霍爾徳氏菌及其近似種蛋白質譜峰圖的質荷比值
[0099]
[0100] 本例中建立的唐菖蒲伯克霍爾徳氏菌的特異性識別圖譜包括22株菌株均具有的 特異性質荷比值，質荷比值包括 3568·4、3864·3、4802·0、5233·8、6829·7、7133·9、7422·1、 7701.7、9602.7、10153.8。需要說明的是，這些值是4種菌株均具有的質荷比值，并通過對具 體檢測值進行平均后獲得的，唐菖蒲伯克霍爾徳氏菌能夠較為準確地反應唐菖蒲伯克霍爾 徳氏菌的特異性識別圖譜。實際上各個菌株還包括其它的質荷比值，但是，這些值并不是唐 菖蒲伯克霍爾徳氏菌所共有的值，這可能是由于各個菌株的個體差異造成的，不具有種識 別作用，因此，不被包括在本例的唐菖蒲伯克霍爾徳氏菌特異性識別圖譜中。此外，從圖5-9 中可見，并非本例中所有特異性質荷比均能被顯示，這是因為圖片顯示的是經過軟件自動 壓縮處理的峰圖，在部分值彼此較接近或者雖然存在該特異性蛋白的質荷比，但是該蛋白 質含量較少的情況下，無法全部被顯示在圖中。
[0101] 本例的蛋白質指紋圖譜模型可單獨的用于唐菖蒲伯克霍爾徳氏菌的檢測鑒定，或 者，整合到其它商業用途的蛋白質檢測分析系統或數據庫，用于唐菖蒲伯克霍爾徳氏菌的 檢測鑒定。
[0102] 四、唐菖蒲伯克霍爾徳氏菌特異性和穩定性檢測
[0103] 1.穩定性檢測
[0104] 按照上述試驗方法對4種唐菖蒲伯克霍爾徳氏菌(Burkholderia gladioli)進行 檢測，每個樣品點采集5張峰圖，4次重復，獲得的20張峰圖與本例中建立的唐菖蒲伯克霍爾 徳氏菌的蛋白質指紋圖譜模型進行比對，并通過軟件計算得到一個l〇g(score)值，log (score)值大于2.2小于3.0則為陽性。結果顯示，所有唐菖蒲伯克霍爾徳氏菌菌株均為陽 性。
[0105] 2.特異性檢測
[0106] 采用所有菌株，按照本例提供的試驗方法進行檢測，每個樣品點采集5張峰圖，獲 得的峰圖與本例中建立的唐菖蒲伯克霍爾徳氏菌的蛋白質指紋圖譜模型進行比對，能夠匹 配并且通過軟件計算得到一個l〇g(score)值，log(score)值大于2.2小于3則為陽性，否則 為陰性。結果顯示，所有4種唐菖蒲伯克霍爾徳氏菌菌株均為陽性，其它供試菌株均為陰性。 部分結果見圖1-5,圖1-5中帶下劃線的數字表示唐菖蒲伯克霍爾徳氏菌共同特有峰對應的 質荷比值。唐菖蒲伯克霍爾徳氏菌近似種的部分質荷比值見表4。
[0107] 從表4可見，唐菖蒲伯克霍爾徳氏菌近似種中也有個別質荷比與唐菖蒲伯克霍爾 徳氏菌相同，這可能是由于彼此之間同源關系較近或其它原因，但是近似種中并沒有全部 的唐菖蒲伯克霍爾徳氏菌的特異性質荷比值，并且，從圖1-5中也可以看到，其質譜圖的圖 形與圖5-9中的唐菖蒲伯克霍爾徳氏菌質譜圖存在很大差異。
[0108] 表4部分唐菖蒲伯克霍爾徳氏菌及其近似種蛋白質譜峰圖的質荷比值
[0109]
[0110] 以上內容是結合具體的實施方式對本發明所作的進一步詳細說明，不能認定本發 明的具體實施只局限于這些說明。對于本發明所屬技術領域的普通技術人員來說，在不脫 離本發明構思的前提下，還可以做出若干簡單推演或替換，都應當視為屬于本發明的保護 范圍。
【主權項】
1. 一種唐菖蒲伯克霍爾德氏菌的蛋白質指紋圖譜模型，其特征在于：由唐菖蒲伯克霍 爾徳氏菌的多個蛋白質的質荷比及其蛋白質波峰強度系數繪制而成，所述多個蛋白質的質 荷比包括3568.4、3864.3、4802.0、5233.8、6829.7、7133.9、7422.1、7701.7、9602.7、 10153.8〇2. 根據權利要求1所述的蛋白質指紋圖譜模型，其特征在于:所述蛋白質的質荷比值及 其波峰強度系數由基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜儀的軟件統計分析得到。3. -種包括權利要求1或2所述的蛋白質指紋圖譜模型的蛋白質檢測分析數據庫。4. 權利要求1或2所述的蛋白質指紋圖譜模型在唐菖蒲伯克霍爾徳氏菌的檢測或鑒定 中的應用。5. -種唐菖蒲伯克霍爾徳氏菌的基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜檢測方法，其特 征在于:包括樣品蛋白質芯片制備，基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜儀檢測，以及樣品 蛋白質圖譜比對； 所述樣品蛋白質圖譜比對是將基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜儀檢測分析獲得 的樣品蛋白質圖譜，與權利要求1或2所述的蛋白質指紋圖譜模型比較;或者在權利要求3所 述的蛋白質檢測分析數據庫中比對。6. 根據權利要求5所述的檢測方法，其特征在于:所述樣品蛋白質芯片制備包括釋放樣 品蛋白質的前處理和點樣，所述點樣的步驟包括，先在質譜靶芯片上滴加樣品上清液，晾干 后再滴加基質溶液。7. 根據權利要求6所述的檢測方法，其特征在于:所述釋放樣品蛋白質的前處理采用的 溶劑包括第一溶劑、第二溶劑和第三溶劑中的至少一種； 第一溶劑為0.1%的三氟乙酸； 第二溶劑為70%的甲酸； 第三溶劑為100%乙腈。8. 根據權利要求6所述的檢測方法，其特征在于:所述基質溶液的溶劑為乙腈：甲醇:無 菌去離子水按體積比1:0.8-1.2:0.8-1.2混合而成;所述基質溶液的溶質為α-氰基-4-羥基 肉桂酸。9. 根據權利要求5-8任一項所述的檢測方法，其特征在于:所述樣品蛋白質圖譜比對采 用基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜儀自帶的軟件及所建立的模型分析數據庫進行，且 比對獲得的1〇8(8(3〇^)值為大于2.2小于3.0。
【專利摘要】本發明公開了一種唐菖蒲伯克霍爾德氏菌的蛋白質指紋圖譜模型及其應用。該模型由唐菖蒲伯克霍爾徳氏菌的蛋白質的質荷比及其波峰強度系數繪制而成，質荷比包括3568.4、3864.3、4802.0、5233.8、6829.7、7133.9、7422.1、7701.7、9602.7、10153.8。檢測方法包括樣品蛋白質芯片制備、基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜儀檢測，以及樣品蛋白質圖譜比對。本發明能定性檢測出樣品中是否含有唐菖蒲伯克霍爾徳氏菌。可用于商業化的唐菖蒲伯克霍爾徳氏菌唐菖蒲伯克霍爾徳氏菌的檢測，特別適用于口岸檢驗檢疫等部門快速、高通量等檢測要求。
【IPC分類】G01N27/64
【公開號】CN105548338
【申請號】CN201510908148
【發明人】吳興海, 馮建軍, 吳振興, 孫敏, 肖西志, 封立平, 段維軍, 鄧叢良, 房保海, 李健勇, 馮黎霞
【申請人】山東出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術中心
【公開日】2016年5月4日
【申請日】2015年12月10日