二氧化錳薄片模擬酶傳感器以及制備方法和t4pnk的檢測方法
【技術領域】
[0001 ]本發明涉及模擬酶傳感器，具體地，涉及一種二氧化錳薄片模擬酶傳感器以及制備方法和T4PNK的檢測方法。
【背景技術】
[0002]T4多核苷酸激酶(PNK)，一種5’激酶，自從它1965在大腸桿菌蛋白提取物感染偶數噬菌體第一次被發現，到目前為止，已成為最常用的分子生物學酶。它可以催化γ-三磷酸腺苷(ATP)的磷酸鹽殘留量5’末端的核苷酸或核苷酸的5。羥基軸承。這對細胞核酸代謝是非常重要的，特別是在細胞對DNA損傷的反應，這與許多人類疾病，如沃納綜合征，Bloom綜合征和1?01:111111111(1-1'1101118011-1'1101118011綜合征等都有著密切聯系。14?爾也被廣泛應用于檢測DNA加合物或寡核苷酸和DNA損傷修復。因此，一個敏感的，精確的用于檢測Τ4ΡΝΚ活性的和檢測其潛在抑制劑的實驗方法的發展是十分有必要的。
[0003]傳統的方法介紹了磷酸化檢測和DNA激酶活性測定，包括活潑的同位素32P標記，聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)，放射自顯影、熒光等方法。然而，這些方法都有著不同程度上的費時，費力，不敏感，或要求放射性標記底物的缺點。
【發明內容】
[0004]本發明的目的是提供一種二氧化錳薄片模擬酶傳感器以及制備方法和T4PNK的檢測方法，該制備方法操作簡單，同時制得的傳感器對于T4PNK的檢測具有靈敏度高、檢測限低和操作簡單的特點。
[0005]為了實現上述目的，本發明提供了一種二氧化錳薄片模擬酶傳感器的制備方法，包括:
[0006]I)將MnO2納米片溶液與TMB(3，3’，5，5’-四甲基聯苯胺)溶液混合以制得MnO2-TMB混合溶液；
[0007]2)將發夾DNA溶解于Tris-HCl緩沖溶液中，然后加入ATP(三磷酸腺苷)與λΕΧ0(λ外切酶)以混合制得DNA溶液；
[0008]3)將MnO2-TMB混合溶液與DNA溶液混合以制得二氧化錳薄片模擬酶傳感器。
[0009]本發明還提供了一種二氧化錳薄片模擬酶傳感器，該二氧化錳薄片模擬酶傳感器通過上述的方法制備而成。
[0010]本發明也提供了一種Τ4ΡΝΚ的檢測方法，包括:
[0011 ] I)將不同已知濃度的Τ4ΡΝΚ溶液與上述的二氧化錳薄片模擬酶傳感器進行接觸反應；
[0012]2)待反應體系的顏色穩定后，檢測反應體系的吸光度，然后以吸光度為縱坐標，Τ4ΡΝΚ的濃度為橫坐標繪制標準曲線或者獲得標準曲線方程；
[0013]3)將未知濃度的Τ4ΡΝΚ溶液與上述的二氧化錳薄片模擬酶傳感器進行接觸反應，接著檢測反應體系的吸光度，然后根據標準曲線或者標準曲線方程以得知未知濃度的T4PNK溶液的濃度。
[0014]通過上述技術方案，本發明提供的二氧化錳薄片模擬酶傳感器的反應機理如圖1所示:在二氧化錳薄片模擬酶傳感器中，二氧化錳納米片能夠起到模擬酶的功效，在模擬酶的存在下，TMB能夠被催化顯色為深藍色，而未經過磷酰化反應的發夾DNA不能夠被λΕΧΟ切割為單鏈，仍然以雙鏈的形式存在；一旦二氧化錳薄片模擬酶傳感器中加入Τ4ΡΝΚ，由于Τ4ΡΝΚ能夠與發夾DNA的5 ’端磷酰化反應，進而使得DNA能夠給特異性的λΕΧΟ切割為單鏈，此時的單鏈DNA對于二氧化錳模擬酶的活性有抑制作用，進而使得TMB的顏色逐漸變淡;整個體系的顏色的深淺與Τ4ΡΝΚ的濃度的對數呈線性關系，進而使得本發明提供的二氧化錳薄片模擬酶傳感器對于Τ4ΡΝΚ的檢測具有優異的靈敏度和檢測限。此外，本發明提供的比色模擬酶傳感器的制備過程中使用的是無標記的DNA，操作簡單，成本很低，避免任何化學標記和修飾，從而使得該傳感器便于大范圍的使用。
[0015]本發明的其他特征和優點將在隨后的【具體實施方式】部分予以詳細說明。
【附圖說明】
[0016]附圖是用來提供對本發明的進一步理解，并且構成說明書的一部分，與下面的【具體實施方式】一起用于解釋本發明，但并不構成對本發明的限制。在附圖中:
[0017]圖1是本發明提供的二氧化錳薄片模擬酶傳感器的工作原理圖；
[0018]圖2是檢測例I中MnO2納米片的低倍SEM圖；
[0019]圖3是檢測例I中MnO2納米片的高倍SEM圖；
[0020]圖4是檢測例2中紫外吸收光譜圖；
[0021]圖5是檢測例3中紫外吸收光譜圖；
[0022]圖6是應用例I中紫外吸收光譜圖；
[0023]圖7是圖6中最高吸光強度結果統計圖；
[0024]圖8是應用例2中不同濃度的λΕΧΟ的紫外吸收光譜圖；
[0025]圖9是應用例2中不同濃度的ATP的紫外吸收光譜圖；
[0026]圖10是應用例3中不同培養時間的紫外吸收光譜圖。
【具體實施方式】
[0027]以下對本發明的【具體實施方式】進行詳細說明。應當理解的是，此處所描述的【具體實施方式】僅用于說明和解釋本發明，并不用于限制本發明。
[0028]本發明提供了一種二氧化錳薄片模擬酶傳感器的制備方法，包括:
[0029]I)將MnO2納米片溶液與ΤΜΒ(3，3’，5，5’-四甲基聯苯胺)溶液混合以制得MnO2-TMB混合溶液；
[0030]2)將發夾DNA溶解于Tris-HCl緩沖溶液中，然后加入ATP(三磷酸腺苷)與λΕΧ0(λ外切酶)以混合制得DNA溶液；
[0031]3)將MnO2-TMB混合溶液與DNA溶液混合以制得二氧化錳薄片模擬酶傳感器。
[0032]在上述的制備方法的步驟I)中，各物料的用量可以在寬的范圍內選擇，但是為了使得制得的二氧化錳薄片模擬酶傳感器具有更優異的靈敏度和檢測限，優選地，在步驟I)中，MnO2納米片溶液中MnO2的濃度為3-15mmol/L，TMB溶液的濃度為30-50mmol/L;并且相對于ImL的MnO2納米片溶液，TMB溶液的用量為l_2mL。
[0033]在上述的制備方法的步驟I)中，混合條件可以在寬的范圍內選擇，但是為了使得制得的二氧化錳薄片模擬酶傳感器具有更優異的靈敏度和檢測限，優選地，在步驟I)中，混合至少滿足以下條件:混合溫度為15-30°C，混合時間為4-1 Omin。
[0034]在上述的制備方法的步驟2)中，各物料的用量可以在寬的范圍內選擇，但是為了使得制得的二氧化錳薄片模擬酶傳感器具有更優異的靈敏度和檢測限，優選地，在步驟2)中，相對于10nmol的發夾DNA，ATP的用量為10-15ηπιο1，λΕΧ0的用量為10-15U，Tris-HCl緩沖溶液的用量為20-30yL;
[0035]在上述的制備方法的步驟I)中，Tris-HCl緩沖溶液以及DNA的種類可以在寬的范圍內選擇，但是為了使得制得的二氧化錳薄片模擬酶傳感器具有更優異的靈敏度和檢測限，優選地，Tris-HCI緩沖溶液的pH為7.1-7.5，發夾DNA的序列號為5 ’ -GGCCTTGGATTGAAGGGAGCTCTACGGCC-3’。
[0036]在上述的制備方法的步驟3)中，各物料的用量可以在寬的范圍內選擇，但是為了使得制得的二氧化錳薄片模擬酶傳感器具有更優異的靈敏度和檢測限，優選地，在步驟3)中，相對于I體積份的DNA溶液，MnO2-TMB混合溶液的用量為3-5體積份。
[0037]在上述的制備方法的步驟3)中，混合條件可以在寬的范圍內選擇，但是為了使得制得的二氧化錳薄片模擬酶傳感器具有更優異的靈敏度和檢測限，優選地，在步驟3)中，混合至少滿足以下條件:混合溫度為15-30°C，混合時間為15-25min。
[0038]在本發明中,MnO2納米片溶液的制備方法可以是本領域中任何一種常規的制備方法，但是為了使得制得的二氧化錳薄片模擬酶傳感器具有更優異的靈敏度和檢測限，優選地，在步驟I)之前，該制備方法還包括:將TMA(四甲基胺鹽)溶液、H2O2溶液與錳源進行接觸反應以制得Μηθ2納米片溶液。
[0039]在上述MnO2納米片溶液的制備方法中，各物料的用量可以在寬的范圍選擇，但是為了使得制得的二氧化錳薄片模擬酶傳感器具有更優異的靈敏度和檢測限，優選地，TMA溶液的濃度為1-1.5mmol/L，H202溶液的濃度為20-40重量％ ;并且，相對于Ig的錳源，TMA的用量為15-25mL，H2O2溶液的用量為2_4mL。
[0040]在上述MnO2納米片溶液的制備方法中，TMA以及錳源的具體種類可以在寬的范圍選擇，但是從成本上考慮，優選地，TMA為四甲基氫氧化銨，錳源為四水合氯化錳硫酸錳、氧化猛和氫氧化猛中的一種或多種。
[0041]在上述MnO2納米片溶液的制備方法中，接觸反應的條件可以在寬的范圍選擇，但是為了提高納米二氧化錳的產率，優選地，接觸反應至少滿足以下條件:反應溫度為15-25°C，反應時間為10-20s。
[0042]本發明還提供了一種二氧化錳薄片模擬酶傳感器，該二氧化錳薄片模擬酶傳感器通過上述的方法制備而成。
[0043 ]本發明也提供了一種T4PNK的檢測方法，包括:
[0044]I)將不同已知濃度的T4PNK溶液與上述的二氧化錳薄片模擬酶傳感器進行接觸反應；
[0045]2)待反應體系的顏色穩定后，檢測反應體系的吸光度，然后以吸光度為縱坐標，T4PNK的濃度為橫坐標繪制標準曲線或者獲得標準曲線方程；
[0046]3)將未知濃度的T4PNK溶液與上述的二氧化錳薄片模擬酶傳感器進行接觸反應，接著檢測反應體系的吸光度，然后根據標準曲線或者標準曲線方程以得知未知濃度的T4PNK溶液的濃度。
[0047]在上述檢測方法中，為了便于T4PNK、發夾DNA以及λΕΧΟ之間能夠充分地反應，優選地，在步驟I)中，接觸反應首先在30-40°C下反應25-35min，然后在70-80°C下反應5-15min。
[0048]以下將通過實施例對本發明進行詳細描述。以下實施例中，牌號A40的發夾DNA(序列號:5 ’-GGCCTTGGATTGAA GGGAGCTCTACGGCC-3 ’)、ATP和T4PNK( 10U/uL)為上海生工公司的市售品，AEX0(10U/uL)是賽默飛世爾公司的市售品，H202(30wt% ) ,MnCl2.4H20(99.99%)為國藥集團化學試劑有限公司(上海，中國)的市售品。
[0049]紫外吸收光譜是通過日本日立公司牌號為UV-3010的紫外-可見分光光度計的檢測而得，SEM檢測室通過日本日立公司牌號為S-4800的電子掃描顯微鏡的檢測而得。
[0050]制備例I
[0051 ] MnO2納米片溶液的制備:
[0052]利用“K.Kai ,Y.Yoshida ,H.Kageyama ,G.Saito ,T.1shigaki , Y.Furukawa andJ.Kawamata，J.Am.Chem.Soc.,2008,130,15938-15943.”報道的方法進行制備:在25°C的敞口條件下，將12mL的四甲基氫氧化銨溶液(1.0M，溶劑為水)、2mL的H2O2溶液(30wt %，溶劑為水)，加入至1mL氯化錳溶液中(含有0.593g的MnCl2.4H20)反應15s以制得MnO2納米片溶液。
[0053]實施例1
[0054]I)在25°C下，將ImL的上述MnO2納米片溶液(1mM)與ImL的TMB(40mM)溶液混合5m