細胞毒性t細胞脫顆粒的流式細胞術檢測方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及生物技術領域，具體而言，涉及一種細胞毒性Τ細胞脫顆粒的流式細胞 術檢測方法。
【背景技術】
[0002] 細胞毒性Τ細胞(Cytotoxic T_lymphocyte，CTL細胞)又稱殺傷性Τ細胞，能夠特異 性殺傷帶抗原的靶細胞，如移植細胞、腫瘤細胞及受微生物感染的細胞等，與自然殺傷細胞 (Natural Killer cell，NK細胞)構成機體抗病毒、抗腫瘤免疫的重要防線。
[0003] CTL細胞殺傷靶細胞最主要途徑一一細胞裂解性殺傷:與靶細胞接觸后，可釋放一 系列細胞毒顆粒物質(脫顆粒），從而導致靶細胞裂解。脫顆粒功能檢測反映了 CTL細胞殺傷 活性，對于細胞毒功能學研究具有重要意義，是醫學基礎及臨床研究中的一項重要工作。
[0004] 傳統的對CTL細胞脫顆粒的檢測多采用熒光鏡檢查，其具有檢測速度慢、精度較 低、準確性較差等問題，使得檢測結果不甚理想。
[0005] 有鑒于此，特提出本發明。
【發明內容】
[0006] 本發明的目的在于提供一種細胞毒性T細胞脫顆粒的流式細胞術檢測方法，所述 的檢測方法可解決現有技術檢測速度慢、精度較低、準確性較差、檢測結果容易受到檢測者 的主觀因素影響等問題。
[0007] 為了實現本發明的上述目的，特采用以下技術方案：
[0008] -種細胞毒性T細胞脫顆粒的流式細胞術檢測方法，包括:通過抗體依賴的細胞介 導的細胞毒性作用激發細胞毒性T細胞脫顆粒，再用流式細胞術檢測激發后與激發前細胞 毒性T細胞中囊泡膜蛋白標志物CD107a的平均熒光強度的比值來評價細胞毒性T細胞的脫 顆粒功能，若比值2 2.8提示脫顆粒功能正常。
[0009] 細胞毒性T細胞(Cytotoxic T-lymph〇Cyte，CTL細胞)胞漿內含有高濃度以囊泡形 式存在的細胞毒性顆粒。溶酶體相關膜蛋白l(CD107a)是囊泡膜蛋白的主要成分。CTL細胞 和NK細胞殺傷靶細胞時，毒性顆粒將到達細胞膜并與細胞膜融合(此時CD107a分子會被轉 運到細胞膜表面），引起顆粒內容物釋放，最終導致靶細胞的死亡。因此，CD107a分子是CTL 細胞脫顆粒的一種敏感標志，與細胞毒活性直接相關，可反映細胞毒性細胞殺傷活性水平。 此外，與顆粒胞吐有關的基因缺陷導致了 CD107a轉移到細胞表面的功能受損。通過檢測CTL 細胞表面表達的CD107a是鑒別是否存在顆粒胞吐功能缺陷的遺傳性疾病的快速手段。 [0010] 流式細胞術(Flow Cytometry，FCM)是一種在功能水平上對單細胞或其他生物粒 子進行定量分析和分選的檢測手段，它可以高速分析上萬個細胞，并能同時從一個細胞中 測得多個參數。通過自然殺傷作用或抗體依賴的細胞介導的細胞毒性作用激發CTL細胞脫 顆粒后，再使用流式細胞術對其CD107a分子增加的幅度進行檢測，可以快速、精度地評價 CTL細胞的脫顆粒能力。
[0011] 如上所述的檢測方法，具體包括以下步驟：
[0012] 1)、分離待檢樣本中的外周血單個核細胞及并計數調整細胞濃度；
[0013] 2)、取細胞毒性T細胞天然靶細胞并計數調整細胞濃度；
[0014] 3)、將步驟1)中的所述外周血單個核細胞和步驟2)中的所述細胞毒性T細胞天然 靶細胞按體積比等比混合后平均分成兩組，向其中一組中加入抗人⑶3抗體作為實驗組，另 一組作為對照組;將兩組孵育后離心并棄上清，得到沉淀；
[0015] 4)、加入流式染色緩沖液重懸步驟3)中所述沉淀，同時加入抗⑶3、⑶8、⑶107a的 流式抗體并孵育；
[0016] 5)、待孵育完成后離心，用流式染色緩沖液洗滌沉淀；
[0017] 6)、洗滌后用流式染色緩沖液重懸混勻細胞并用流式細胞儀進行檢測；
[0018] 7)、統計⑶3+⑶8+D107a+的細胞中⑶107a的平均熒光強度，并計算實驗組與對照 組的平均熒光強度的比值用以評價細胞毒性T細胞的脫顆粒功能，若比值2 2.8提示脫顆粒 功能正常。
[0019] Q)3(cluster of differentiation 3,分化簇3)受體僅存在于T細胞表面，因而可 用作T細胞的標志物；
[0020] Q)8(cluster of differentiation 8,分化簇8)受體表達于細胞毒性T細胞上，可 作為細胞毒性T細胞的標志物；
[0021 ]⑶107a分子作為CTL細胞脫顆粒的敏感標志物。
[0022] 步驟3)中加入的抗人CD3抗體選用購自4abio公司，目錄號為FHF003-100的Mouse anti Human CD3 Monoclonal Antibody，FITC或目錄號為FHU003-100的Mouse anti-Human CD3 Monoclonal Antibody,Purified；
[0023] 步驟4)中加入的三種抗體，CD3抗體（Anti-Human CD3 FITC 100 tests)購自 eBioscience公司，目錄號為11-0036-42,或采用購自4abio公司，目錄號為FHF003-100的 Mouse anti-Human CD3 Monoclonal Antibody,FITC;CD8抗體（PerCP anti-human CD8)購 自Biolegend公司，目錄號為344708;CD107a抗體【Anti-HumanCD107a(LAMP-l)PE 100七68七8】購自613;[08(^61106公司，目錄號為12-1079-42。
[0024] 優選的，如上所述的檢測方法，所述細胞毒性T細胞天然靶細胞為P815細胞。
[0025] Ρ815細胞為肥大細胞瘤細胞，可通過抗體依賴的細胞介導的細胞毒性作用(ADCC) 激發細胞毒性Τ細胞脫顆粒。
[0026]優選的，如上所述的檢測方法，在步驟3)中，抗人⑶3抗體的濃度為0.25~0.5yg/ 100μ1〇
[0027]優選的，如上所述的檢測方法：
[0028] 在步驟1)中，所述細胞濃度為1 · 8~2 · 2 X 106/ml;
[0029] 在步驟2)中，所述細胞濃度為1 · 8~2 · 2 X 106/ml。
[0030] 優選的，如上所述的檢測方法，在步驟3)中，孵育條件為：
[0031] 于37°C，5%C〇2培養箱中共孵育2.5~3.5h。
[0032] 優選的，如上所述的檢測方法，在步驟4)中，孵育條件為：
[0033] 室溫避光孵育15~25min。
[0034]優選的，如上所述的檢測方法，所述流式染色緩沖液的配方為：
[0035] 含有2·0%FBS和2·0mMEDTA的lXPBS溶液。
[0036] 優選的，如上所述的檢測方法，在步驟2)、步驟3)和步驟5)中，所述離心的轉速均 為1200~1600rpm，離心時間均為4~6min。
[0037] 優選的，如上所述的檢測方法：
[0038] 在步驟4)中，CD3、CD8的抗體的濃度為0.45~1.0yg/100yl;CD107a的抗體濃度為 0.06~0.125yg/100yl。
[0039] 與現有技術相比，本發明的有益效果為：
[0040] 1)、本申請提供的細胞毒性T細胞脫顆粒的流式細胞術檢測方法，檢測快速，通量 大，準確度高，且人為因素影響較小。
[0041 ] 2)、通過對天然刺激物的選擇、效靶細胞配比及孵育時間等關鍵技術細節進行優 選限定，建立了穩定規范的技術流程。
【附圖說明】
[0042] 為了更清楚地說明本發明實施例或現有技術中的技術方案，以下將對實施例或現 有技術描述中所需要使用的附圖作簡單地介紹。
[0043] 圖1為通過抗人⑶3抗體及靶細胞P815激發的CTL細胞脫顆粒，進而通過流式細胞 術進行檢測的實驗結果圖；圖A為激發前，圖B為激發后。
【具體實施方式】
[0044]下面將結合實施例對本發明的實施方案進行詳細描述，但是本領域技術人員將會 理解，下列實施例僅用于說明本發明，而不應視為限制本發明的范圍。實施例中未注明具體 條件者，按照常規條件或制造商建議的條件進行。所用試劑或儀器未注明生產廠商者，均為 可以通過市售購買獲得的常規產品。
[0045] 實施例1
[0046] 細胞毒性T細胞脫顆粒的流式細胞術檢測方法，包括以下步驟：
[0047] S11、分離待檢樣本中的外周血單個核細胞及并計數調整細胞濃度；
[0048] S12、取細胞毒性T細胞天然靶細胞并計數調整細胞濃度；
[0049] S13、將步驟SI 1中的所述外周血單個核細胞和步驟S12中的所述細胞毒性T細胞天 然靶細胞按體積比等比混合后平均分成兩組，向其中一組中加入抗人⑶3抗體作為實驗組， 另一組作為對照組;將兩組孵育后離心并棄上清，得到沉淀；
[0050] S14、加入流式染色緩沖液重懸步驟S13中所述沉淀，同時加入抗⑶3、⑶8、D107a的 流式抗體并孵育；
[0051 ] S15、待孵育完成后離心，用流式染色緩沖液洗滌沉淀；
[0052] S16、洗滌后用流式染色緩沖液重懸混勻細胞并用流式細胞儀進行檢測；
[0053] S17、統計⑶3+⑶8+的細胞中⑶107a的平均熒光強度，并計算實驗組與對照組的平 均熒光強度的比值用以評價細胞毒性T細胞的脫顆粒功能，若比值2 2.8提示脫顆粒功能正 常。
[0054] 實施例2
[0055]細胞毒性T細胞脫顆粒的流式細胞術檢測方法，包括以下步驟：
[0056] S21、分離待檢樣本中的外周血單個核細胞及并計數調整細胞濃度至1.8 ΧΙΟ6/ ml;
[0057] S22、取細胞毒性T細胞天然靶細胞P815細胞并計數調整細胞濃度至1.8 X 106/ml;
[0058] S23、將步驟S21中的所述外周血單個核細胞和步驟S22中的所述細胞毒性T細胞天 然靶細胞按體積比等比混合后平均分成兩組，向其中一組中加入抗人⑶3抗體作為實驗組 (抗體的濃度為0.