一種多肽抗原檢測牛結核分枝桿菌抗體的elisa試劑盒的制作方法
【技術領域】
[0001] 本發明屬于生物技術檢測技術領域。
【背景技術】
[0002] 牛結核是由牛結核分枝桿菌引起的人獸共患傳染病。在國際上已引起巨大經濟損 失，牛結核可W感染其他反當動物和人類，野生動物是其儲存宿主，給疾病控制與根除造成 很大困難。目前，用于牛結核標準診斷方法是用結核菌素進行皮內試驗，該方法和其他細胞 介導的免疫學檢測(如r-IFN試驗，淋己細胞增生試驗)均有一些優缺點。首先是由于皮內試 驗是機體對抗原的遲發型變態反應，敏感性和特異性較低，也不可能確定對結核菌素反應 的是牛結核分枝桿菌，還是禽結核分枝桿菌，或是環境中的其他分枝桿菌。其次，在感染早 期細菌載量雖然較少，但W細胞介導的免疫反應為主，而在感染嚴重期細菌載量雖然較高 但細胞介導的免疫反應可能缺失，動物可能成為對細胞介導的免疫反應無應答。第=，72小 時內需要操作動物個體兩次，W獲得檢測結果。第四，細胞介導的免疫學檢測價格昂貴，需 要專業培訓，解讀檢測結果。第五，環境中的分枝結核桿菌或BCG疫苗免疫的動物可能使檢 測結果成為假陽性。因此，需要建立敏感、易操作和應用的檢測牛結核的血清學方法，運種 方法能夠區別牛結核和禽結核，或其他環境分枝結核桿菌。
[0003] 近年來有一些用于牧場檢測的血清學方法，但敏感性較低，特異性也較差，或許是 由于使用了病原分支桿菌和環境分支桿菌表達的抗原提取物。運可W通過利用病原唯一抗 原進行加 W改進，而且已經取得一定進展。
【發明內容】
[0004] 為了克服現有技術的缺陷，本發明的目的在于提供一種多膚抗原檢測牛結核分枝 桿菌抗體的化ISA試劑盒。
[0005] 本發明包括牛結核分枝桿菌特異性多膚抗原包被的酶標板、陰性血清、陽性血清、 抗體稀釋液、用辣根過氧化物酶標記的抗牛I gG酶標抗體、底物顯色液、終止液;所述牛結核 分枝桿菌特異性多膚抗原為W下五種多膚抗原中的至少任意一種：
[0006] 所述五種多膚抗原為利用牛結核分支桿菌特異性多膚，采用體外人工合成方法取 得的多膚抗原。
[0007] 本發明利用人工合成多膚作為抗原，W獲得靈敏度高、特異性高、操作簡單、并快 速檢測牛結核分枝桿菌抗體的化ISA檢測試劑盒。
[0008] 本發明的有益效果:本發明采用牛結核分枝桿菌特異性多膚抗原作為包被抗原， 有效提高多膚與目標抗體的結合效率，從而顯著提高可檢測靈敏度，同時顯著降低非特異 背景讀值，特異性高，本發明的牛結核分枝桿菌抗體的化ISA試劑盒具有操作簡單、診斷速 度快、在進行大規模檢測中經濟方便等優點，是一種便于普及的好方法，具有廣泛的應用前 景。采用本發明的化ISA檢測試劑盒檢測牛結核分枝桿菌抗體，降低了檢測成本，有利于推 廣使用。
[0009] 進一步地，本發明所述牛結核分枝桿菌特異性多膚抗原包被的酶標板的制備方法 是:取96孔酶標板，每孔10化L牛結核分枝桿菌特異性多膚抗原，4°C過夜包被，包被濃度為 O.Oliig/mL~扣g/mL，用PBST洗涂液25化1/孔洗涂2~4次后拍干，用封閉液15化1/孔，37 °C封閉化，洗涂液PBST 25化1/孔洗涂3次后拍干，放入真空袋，4°C、抽真空保存。
[0010] 所述陽性血清為用抗體稀釋液按照體積比為1:20~100的比例將牛結核分枝桿 菌標準陽性血清稀釋后取得的稀釋陽性血清;所述陰性血清為用抗體稀釋液按照體積比為 1: 20~100的比例將牛結核分枝桿菌標準陰性血清稀釋后取得的稀釋陰性血清。所述標準 陽性、陰性血清用于評價試劑盒檢測結果的有效性。
[0011] 所述抗體稀釋液為0.1%BSA，W用于保持血清抗體的效價和穩定性，減少非特異 性。
[0012] 所述用辣根過氧化物酶標記的抗牛IgG酶標抗體是用HRP保護液按1:2000-1:5000 比例稀釋后的抗牛IgG酶標抗體。保護液保護酶標抗體的穩定性和效價。
[0013] 所述底物顯色液為TMB，使陽性樣本呈現不同深淺顏色，從而判定陽性的強弱。
[0014] 所述終止液為0.1SDS%或2M的出S化，使酶促反應終止。
【具體實施方式】
[0015] -、本發明中所采用的牛結核分枝桿菌特異性多膚的制備方法： 1、利用牛結核分支桿菌特異性多膚，體外人工合成作為抗原快速檢測牛結核分枝桿菌 的抗體。
[0016] 牛結核分枝桿菌多膚抗原的制備過程： 1)稱取RINK樹脂3 g(取代度0.3 mmol/g)于150 ml的反應器中，用50ml的二氯甲燒 (DCM)浸泡。
[0017] 2)2小時后，用3倍樹脂體積的氮-二甲基甲酯胺(DM巧洗涂樹脂，然后抽干，如此重 復四次，將樹脂抽干后待用。
[001引 3)向反應器中加入一定量的20%贓晚（贓晚/DMF)，放在脫色搖床上搖晃20min，W 此來脫去樹脂上的Fmoc保護基團。脫完保護后用3倍樹脂體積的DMF洗涂四次，然后抽干。
[0019] 4)取少量樹脂用巧S酬（九井水合巧S酬）法檢測（檢A、檢B各兩滴，100°C反應 Imin)，樹脂有顏色，說明脫保護成功。
[0020] 5)稱取C端第一個氨基酸適量和1-徑基-苯拼S挫(冊BT)適量于50ml的離屯、管中， 加入20ml的DM問尋其溶解，然后加入3ml的N，N-二異丙基碳二亞胺(DIC)振蕩搖勻Imin,待溶 液澄清后加入到反應器中，然后將反應器置于30°C的搖床中反應。
[0021] 6)2小時后，用一定量的醋酸酢封頭(醋酸酢：DIEA : DCM=1:1:2)半小時，然后用 3倍樹脂體積的DMF洗涂四次，抽干待用。
[0022] 7)向反應器中加入一定量的20%贓晚（贓晚/DMF=I :4)，放在脫色搖床上搖晃20 min, W此來脫去樹脂上的Fmoc保護基團。脫完保護后用DMF洗涂四次，然后抽干。
[0023] 8)取少量樹脂用巧S酬（九井水合巧S酬）法檢測（檢A、檢B各兩滴，100°C反應 Imin)，樹脂有顏色，說明脫保護成功。
[0024] 9)稱取后面第二個氨基酸適量和冊BT適量于50 ml的離屯、管中，加入25 ml的DMF 將其溶解，然后加入2.5 ml的DI訝辰蕩搖勻Imin,待溶液澄清后加入到反應器中，然后將反 應器置于30°C的搖床中反應。
[0025] 10 ) 1小時后，取少量樹脂檢測，用巧S酬法檢測（檢A、檢B各兩滴，100°C反應 Imin),若樹脂為無色，說明反應完全;若樹脂有顏色，說明縮合不完全，繼續反應。
[0026] 11)待反應完全后，用DMF洗涂樹脂四次，然后抽干，向反應器中加入一定量的20% 贓晚（贓晚/DMF=I :4)，放在脫色搖床上搖晃20min，W此來脫去樹脂上的Fmoc保護基團。脫 完保護后用DMF洗涂四次，然后抽干檢測保護是否脫去。
[0027] 12)按照步驟9)至11)依次接上后面的氨基酸。
[00%] 13)待接上最后一個氨基酸后，脫去保護，用DMF洗涂四次，然后用甲醇將樹脂抽 干。然后用95切割液(=氣乙酸：1，2乙二硫醇：3，異丙基硅烷:水=95:2: 2:1)將多膚從樹脂 上切割下來(每克樹脂加 IOml切割液），并用冰乙酸(切割液：乙酸=1:9)離屯、沉降四次。最后 用HPLC分離純化，再凍干，得到一定純度的多膚。
[0029] 2、牛結核分枝桿菌反應原性多膚的篩選： 通過DNASta;r、GenebankJrotScale等分析軟件對牛結核分枝桿菌蛋白的抗原表位進 行預測，確定天然抗原的氨基酸序列，然后尋找該膚段所針對的抗原決定簇。使用化ISA檢 測不同多膚與牛結核分枝桿菌抗血清的反應，最后選出具有良好反應的牛結核分枝桿菌反 應原性多膚。
[0030] 有效多膚段的選擇和確定，通過DNAStarXenebankJrotScale等分析軟件對牛 牛結核分枝桿菌蛋白的抗原表位進行預測，確定天然抗原的氨基酸序列，然后尋找該膚段 所針對的抗原決定簇(邱itopes)，使用化ISA檢測不同多膚與牛結核分枝桿菌抗血清的反 應，最后選出具有良好反應的W下五種牛結核分枝桿菌多膚。
二、牛結核分枝桿菌特異性多膚抗原包被的酶標板的制備： 取96孔酶標板，每孔10化L上述任意一種牛結核分枝桿菌特異性多膚抗原，4°C過夜包 被，包被濃度為0.0化g/mL~化g/mL，用PBST洗涂液25化1/孔洗涂2~4次后拍干，用封閉 液15化1/孔，37°C封閉化，洗涂液PBST 250iil/孔洗涂3次后拍干，放入真空袋中，加入干 燥劑，抽真空，4°C保存。
[0032] S、組裝試劑盒： 各試劑盒包括牛結核分枝桿菌特異性多膚抗原包被液包被的酶標板;陽性血清和陰性 血清各1管，其中陽性血清為牛結核分枝桿菌標準陽性血清，陰性血清為牛結核分枝桿菌 標準陰性血清；用辣根過氧化物酶標記的抗牛IgG的酶標抗體1瓶;抗體稀釋液1瓶;底物 顯色液I瓶;終止液I瓶。
[0033] 其中，陽性血清為用抗體稀釋液按照體積比為1: 20~100的比例將牛結核分枝桿 菌標準陽性血清稀釋后取得的稀釋陽性血清。
[0034] 陰性血清為用抗體稀釋液按照體積比為1:20~100的比例將牛結核分枝桿菌標 準陰性血清稀釋后取得的稀釋陰性血清。
[003