測定脂蛋白質的膽甾醇運載能力的方法及試劑盒的制作方法
【專利說明】測定脂蛋白質的膽當醇運載能力的方法及試劑盒 【技術領域】
[0001] 本發明設及測定脂蛋白質的膽醬醇運載能力的方法。另外，本發明設及脂蛋白質 的膽醬醇運載能力的測定用試劑盒。 【【背景技術】】
[0002] 近年、關注血中的脂蛋白質的功能的質的指t不被關注。
[0003] 作為研究高比重脂蛋白質（皿L)的功能的方法，例如，在Sankaranarayanan S. et al.，A sensitive assay for ABCAI-mediated cholesterol efflux using BODIPY-cholesterol.J. Lipid Res.，vol. 52, p. 2332-2340(2001)中記載了使用被巧光標 記的膽醬醇及培養細胞的方法。
[0004] 在此方法中，通過測定從運載被巧光標記的膽醬醇的巨隧細胞由皿L置換出的被 標記的膽醬醇量，研究皿L的膽醬醇排出功能。此方法包括，（1)使巨隧細胞運載被標記的 膽醬醇，似添加酷基CoA膽醬醇酷基轉移酶的抑制劑，抑制在細胞內的膽醬醇的醋化，（3) 添加皿L而刺激巨隧細胞，及（4)回收培養上清及細胞增溶液，定量運些液中的被標記的膽 醬醇的4個工序。
[000引另一方面，在W02012/104411中記載了不使用培養細胞，由被巧光標記的膽醬醇 判斷脂質異常癥的方法。
[0006] 在此方法中，將含低比重脂蛋白質（LDL)或皿L等的各種的脂蛋白質的周緣的單 層用被巧光標記的膽醬醇（膽醬醇巧）標記，基于測定標記的脂蛋白質而得到的巧光光譜， 判斷受試者是脂質異常癥與否。
[0007] 再有，在此文獻中記載，可將標記的脂蛋白質和游離的被巧光標記的膽醬醇由超 離屯、分離法、透析、或者使用凝膠過濾柱的FPLC分離。 【
【發明內容】
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[000引【發明要解決的技術課題】
[0009] 本發明人關注脂蛋白質的膽醬醇運載能力，探討簡便地測定其的方法。于是，本發 明人發現可使用被標記的膽醬醇和與脂蛋白質結合的抗體，簡便地測定脂蛋白質的膽醬醇 運載能力，從而完成本發明。
[0010] 【解決課題的技術方案】
[0011] 從而提供包括通過使樣品中的脂蛋白質和被標記的膽醬醇接觸，使脂蛋白質運載 被標記的膽醬醇的工序、通過使運載被標記的膽醬醇的脂蛋白質和與脂蛋白質結合的抗體 接觸，形成脂蛋白質和抗體的復合物的工序、測定從此復合物發生的標記的工序，及測定脂 蛋白質的膽醬醇運載能力的方法。
[0012] 再者提供脂蛋白質的膽醬醇運載能力測定用試劑盒，其含：含被標記的膽醬醇的 第1試劑，及含與脂蛋白質結合的抗體的第2試劑。
[0013] 【發明效果】
[0014] 由本發明使簡便地測定脂蛋白質的膽醬醇運載能力變得可能。 【【附圖說明】】
[0015] 【圖1】是顯示含有棚二化咯亞甲基骨架結構的巧光團的被巧光標記的膽醬醇由 皿L醋化的照片。
[0016] 【圖2】是顯示含有苯并嗯二挫骨架結構的巧光團的被巧光標記的膽醬醇由皿L醋 化的照片。
[0017] 【圖3】是顯示由本實施方式的方法的測定結果與由W往方法的測定結果相關的分 布圖。
[001引【圖4A】是顯示由夾屯、ELISA法，皿L被固定化到固相的抗載脂蛋白AI (ApoAU抗 體捕獲的坐標圖。
[0019] 【圖4B】是顯示被抗ApoAI抗體捕獲的皿L不運載被巧光標記的膽醬醇的坐標圖。
[0020] 【圖5A】是顯示本實施方式的試劑盒之一例的圖。圖中，11表示含被標記的膽醬醇 的第1試劑、22表示含與脂蛋白質結合的抗體的第2試劑。
[0021] 【圖5B】是顯示含被標記的膽醬醇、與脂蛋白質結合的抗體和固相的本實施方式的 試劑盒之一例的圖。圖中，11表示含被標記的膽醬醇的第1試劑、22表示含與脂蛋白質結 合的抗體的第2試劑、33表示固相（96孔微平板）。
[0022] 【圖5C】是顯示含被標記的膽醬醇和固定化與脂蛋白質結合的抗體的固相的本實 施方式的試劑盒之一例的圖。圖中，11表示含被標記的膽醬醇的第1試劑、33表示固定化 與脂蛋白質結合的抗體的固相（96孔微平板）。
[0023] 【實施方式】
[0024] W下參照附圖描述本發明的優選的實施方式。
[00巧]測定本實施方式的脂蛋白質的膽醬醇運載能力的方法（W下也簡稱為"測定 方法"），也可如后述一樣，向樣品中的脂蛋白質直接運載被標記的膽醬醇，所W如W往 的膽醬醇排出功能的測定法（例如，Sankaranarayanan S.et al.，A sensitive assay for ABCAI-mediated cholesterol efflux using BODIPY-cholesterol. J. Lipid Res.， vol. 52, p. 2332-2340(2001)所述的如方法）一樣，不使用巨隧細胞等的蓄積膽醬醇的細 胞。從而，本實施方式的測定方法，在后述的任何的工序中都可在無細胞系統中進行。其中， 無細胞系統是指W脂蛋白質的膽醬醇運載能力的測定中利用的目的不添加細胞。即，本實 施方式的測定方法可不為了測定添加細胞而利用其性質及功能等而實施。再有認為，在本 實施方式中，即使使用的樣品中含受試者來源的細胞時，其細胞自體幾乎不影響脂蛋白質 的被標記的膽醬醇的運載，測定方法被視為無細胞系統。
[0026] 在本實施方式的測定方法中，首先進行通過使樣品中的脂蛋白質和被標記的膽醬 醇接觸，使被標記的膽醬醇運載到脂蛋白質的工序。在本實施方式中，樣品是，只要是含哺 乳動物的脂蛋白質、優選為人的脂蛋白質，就不特別限定。作為那樣的樣品，例如，可舉出血 液、血清及血漿等的血液樣品。
[0027] 成為本實施方式的測定對象的脂蛋白質可為皿L L化、中間比重脂蛋白質（IDL)、 超低比重脂蛋白質（VLDL)、或者乳糜微粒（CM)。皿L是有1. 063g/mL W上的密度的脂蛋白 質。LDL是有1.019g/mLW上、不足1.063g/mL的密度的脂蛋白質。IDL是有1.006g/mLW 上、不足I. 019g/mL的密度的脂蛋白質。VLDL是有0. 95g/mL W上、不足I. 006g/mL的密度 的脂蛋白質。CM是有不足0.95glmL的密度的脂蛋白質。在優選的實施方式中，在上述的脂 蛋白質之中，W皿L作為測定對象。
[002引在本實施方式的測定時，可由超離屯、分離法或聚乙二醇（PEG)沉淀法等的公知的 方法分離血液樣品，取得含指定的脂蛋白質的級分。
[0029] 在本實施方式中，為了調節脂蛋白質濃度，將上述的血液樣品及指定的脂蛋白質 級分用水性介質稀釋而得到的液也可作為樣品使用。作為那樣的水性介質，例如，可舉出 水、生理鹽水、憐酸緩沖生理鹽水（PB巧及Tris-HCl等的緩沖液等。再有，樣品中的脂蛋白 質濃度，由于作為脂蛋白質的主要的構成成分的ApoAI的濃度成為指標，在本實施方式中， 也可取樣品的一部分，將其中所含的ApoAI的濃度由公知的免疫學測定法（例如免疫比濁 法）測定。基于得到的ApoAI的濃度，可調節樣品中的脂蛋白質濃度。
[0030] 在樣品中，根據需要，也可添加牛血清白蛋白度SA)或如脂質體一樣的封閉劑等。 另外，由于知脂蛋白質醋化膽醬醇而運載，也可將對于由脂蛋白質的膽醬醇的醋化反應成 為必要的脂肪酸或含其的組合物（例如脂質體）添加到樣品。
[0031] 在本實施方式的測定方法中，作為脂蛋白質運載的膽醬醇，使用被標記的膽醬醇。 被標記的膽醬醇是在膽醬醇分子的一部分結合成為標記的分子的物質。其中，被標記的膽 醬醇中的膽醬醇部分可有天然存在的膽醬醇的結構，或者，也可有從與天然存在的膽醬醇 的C17位結合的烷基鏈除去1個W上的亞甲基及/或甲基的膽醬醇（也稱為去甲膽固醇） 的結構。
[0032] 如上所述，由于脂蛋白質醋化膽醬醇而運載，更優選為使用由脂蛋白質醋化的被 標記的膽醬醇。再有，在本實施方式的方法中，被標記的膽醬醇，在與樣品接觸時，被該樣品 中含的活體來源的卵憐脂-膽醬醇酷基轉移酶化CAT)醋化。確認由脂蛋白質的被標記的 膽醬醇的醋化的方法自體是現有技術中公知的，可由本領域技術人員常規進行。
[0033] 標記優選是發生可從標記自體檢測的信號的物質。例如，可舉出巧光物質、顯色物 質、發光物質等。運些中，特別優選為巧光物質。巧光物質優選為含巧光團，所述巧光團具 有有極性結構。在現有技術領域中，含有被巧光標記的膽醬醇及具有有極性結構的巧光團 的標記物質自體是公知的。
[0034] 作為那樣的含巧光團，所述巧光團具有有極性結構的被巧光標記的膽醬醇，例如， 可舉出含有下述的式（I):
[003引【化1】
[0036]
[0037] 所表示的棚二化咯亞甲基度ODIPY(注冊商標））骨架結構或下述的式（II):
[003引【化2】
[0039]
[0040] 所表示的苯并嗯二挫骨架結構的巧光團的被巧光標記的膽醬醇等。
[0041] 被標記的膽醬醇可由公知的方法，通過將標記附加到膽醬醇制造。再有，膽醬醇中 附加標記的位置不特別限定，可根據使用的標記適宜決定。膽醬醇和標記的結合樣式不特 別限定，但優選為兩者經共價鍵直接鍵合。
[0042] 在本實施方式中，也可使用市售的被標記的膽醬醇。例如，作為上述的含有BODIPY 骨架結構的巧光團的被巧光標記的膽醬醇，可舉出下述的式（III):
[0043] 【化3】
[0044]
[0045] 所表示的被巧光標記的膽醬醇（23