Pei納米粒子構建的免疫傳感器的制備方法及應用
【技術領域】
[0001 ]本發明屬于新型功能材料和生物傳感檢測技術領域，尤其是涉及一種Ru-Si〇2@ PEI納米粒子構建的免疫傳感器的制備方法及應用。
【背景技術】
[0002] 神經元特異性烯醇化酶(NSE)作為高特異性和高靈敏性的小細胞肺癌的腫瘤標記 物，被廣泛的應用于醫療診斷。而且，NSE活性水平改變同小細胞肺癌的臨床過程具有很好 的相關性。患者經治療后，若腫瘤縮小，NSE水平明顯降低，相反，若NSE在治療過程中不降 低，臨床上腫瘤也不見治療反應。由于對NSE含量的測定可以為疾病的診斷及治療情況提供 重要信息，目前已經發展了ELLSA法、熒光免疫法，電化學免疫法和化學發光法等對NSE水平 進行分析檢測。然而，每種方法都有其優缺點，發展新的簡單靈敏的NSE檢測方法仍然十分 重要。
[0003] 電化學發光分析方法由于靈敏度高、操作簡便和設備簡單等優點被廣泛用于環境 監測、藥物分析、生物傳感等領域。由于電化學發光物本身產生的發光信號較低，通常會在 體系中加入共反應劑來提高發光信號進而提高分析檢測效果。近來，自增強電化學發光復 合物將發光物及其共反應劑同時負載到復合物上，縮短了電子傳遞距離，提高了發光效率， 使得體系發光信號大大提高的同時，避免了共反應劑的加入，從而進一步簡化了電化學發 光檢測體系。基于自增強電化學發光復合物構建的傳感器，靈敏度高，選擇性好且制備過程 簡單。
【發明內容】
[0004] 針對現有技術中存在不足，本發明提供了一種Ru-Si02@PEI納米粒子構建的免疫 傳感器的制備方法，主要用于神經元特異性烯醇化酶的檢測，其具有靈敏度高、線性范圍 寬、檢測限低的特點。
[0005] 本發明是通過以下技術手段實現上述技術目的的。
[0006] 一種Ru-Si02@PEI納米粒子構建的免疫傳感器的制備方法，包括如下步驟：
[0007] SI :Ru-Si〇2@PEI納米粒子溶液的制備:將Ru-Si〇2納米粒子水分散液加入聚乙烯亞 胺(PEI)中，經攪拌、離心分離，所得產物水洗，得到Ru-Si02@PEI納米粒子水分散液；
[0008] S2:將玻碳電極拋光打磨、水洗后，在其表面滴加步驟S1中所述Ru-Si02@PEI納米 粒子水分散液，晾干;再在玻碳電極表面滴加全氟磺酸溶液，晾干;隨后將其放入氯金酸溶 液中電鍍，得到表面沉積有金納米粒子的電極A;
[0009] S3:步驟S2中得到的電極A在神經元特異性烯醇化酶抗體溶液中浸泡，4°C作用 12h，隨后對電極清洗，得到電極B;
[0010] S4:將步驟S4中得到的電極B在牛血清白蛋白溶液中浸泡，清洗后制得基于Ru-Si02@PEI納米粒子構建的免疫傳感器。
[0011 ] 優選的，步驟si中所述Ru-Si〇2納米粒子的制備過程如下:將7.08mL聚乙二醇辛基 苯基醚（Triton X-100)、30mL環己烷、7.2mL正己醇和1.36mL水混合成油包水微乳滴混合 液，然后加入320yL·^度為O.lmol/L的聯吡啶釕(Ru(bpy) 32+)溶液，攪拌30min后，使混合液 混合均勻;接著依次加入400yL正硅酸乙酯和240yL氨水，持續攪拌24h;反應結束后，向體系 中加入30mL丙酮，靜置30min后，下層沉淀先用乙醇洗四次再用二次蒸餾水洗四次；制得Ru-Si0 2納米粒子，最后將得到的Ru-Si02納米粒子分散到10mL水中備用。
[0012] 優選的，步驟S1中Ru-Si〇2納米粒子溶液的濃度為0.5mg/mL，所述聚乙稀亞胺 (PEI)的濃度為5-40mg/mL，所述聚乙烯亞胺(PEI)和Ru-Si02納米粒子溶液的體積比為1:1; 攪拌的時間為9-15h;所得產物水洗3次以上。
[0013] 優選的，步驟S2中所述玻碳電極的直徑為3mm，玻碳電極采用AI2O3拋光粉打磨、超 純水清洗;所述Ru-Si02@PEI納米粒子溶液的濃度為0.1-0.9mg/mL，體積為5yL;所述全氟磺 酸溶液的質量濃度為〇.04%，體積為2yL;玻碳電極在質量濃度為1 %的氯金酸溶液中-0.2V 下電鍍15s。
[0014] 優選的，步驟S3中所述電極清洗溶液為含0.5%Tween的0.01M的pH=7.4磷酸鹽緩 沖液。
[0015] 優選的，步驟S4中在37°C下，電極B在牛血清白蛋白溶液中浸泡lh，之后用含0.5 % Tween的0.01M的pH = 7.4磷酸鹽緩沖液清洗;所述神經元特異性稀醇化酶抗體溶液的濃度 為lyg/mL，體積為80yL。
[0016] 上述免疫傳感器在檢測神經元特異性烯醇化酶中的應用。
[0017] 優選的，包括如下步驟：
[0018] 將制得的傳感器浸入到80yL的濃度為lOfg/mL-lOng/mL的不同神經元特異性稀醇 化酶溶液中，37°C下作用80min;之后用含0.5 %Tween的0.01M的pH=7.4磷酸鹽緩沖液對電 極進行清洗，得到的電極作為工作電極，飽和Ag/AgCl電極作為參比電極，鉑絲電極作為對 電極，電化學發光信號由MPI-E電化學發光分析儀記錄和檢測;在0.1M的pH = 7.5的磷酸鹽 緩沖液中進行測試;掃描電壓范圍0-1.35V，掃描速度0.1 V.s'光電倍增管高壓設為800V。
[0019] 本發明的有益效果：
[0020] (1)利用自增強電化學發光物構建免疫傳感器，無需額外加入共反應劑，簡化實驗 步驟，節約實驗試劑。
[0021] (2)本發明制備的電化學發光免疫傳感器用于經元特異性烯醇化酶的檢測，最優 條件下，檢測線性范圍為10fg/mL-10ng/mL，橫跨七個數量級，檢測限低至10fg/mL ;將構建 的傳感器的分析效果與文獻報道的其它方法進行比較，結果較好。
【附圖說明】
[0022] 圖1是Ru-Si02@PEI納米粒子構建的傳感器制備工藝過程圖。
[0023] 圖2是本發明中制備的Ru-S i 02@PE I納米粒子的TEM圖片。
【具體實施方式】
[0024]下面結合附圖以及具體實施例對本發明作進一步的說明，但本發明的保護范圍并 不限于此。
[0025] 實施例1
[0026] 如圖1所示：
[0027] SI :Ru-Si02@PEI納米粒子溶液的制備：
[0028] 將7.08mL聚乙二醇辛基苯基醚（Triton X-100)、30mL環己烷、7.2mL正己醇和 1.36mL水混合成油包水微乳滴混合液，然后加入320yL·^度為0. lmol/L的聯吡啶釕溶液，攪 拌30min后，依次加入400yL正娃酸乙酯和240yL氨水，持續攪拌24h;反應結束后，向體系中 加入30mL丙酮，靜置30min后，下層沉淀先用乙醇洗四次再用二次蒸餾水洗四次，制得Ru-Si0 2納米粒子，最后將得到的Ru-Si02納米粒子分散到10mL水中備用；
[0029] 取10mL濃度為0.5mg/mL上述Ru-Si02納米粒子水分散液加入10mL濃度為5mg/mL、 的聚乙烯亞胺(PEI)中，攪拌9h，離心并將所得產物用水洗滌3次，得到Ru-Si02@PEI納米粒 子，見圖2;
[0030] S2:將直徑為3mm的玻碳電極經Al2〇3拋光粉打磨、超純水清洗；取5yL 0.1mg/mL Ru-Si02@PEI納米粒子溶液滴加到電極表面，室溫下晾干；隨后在電極表面滴加2yL質量濃 度0.04%全氟磺酸溶液(Naf ion)，室溫下瞭干，防止Ru-Si〇2@PEI納米粒子從電極上掉落；； 隨后放入質量濃度為1 %的氯金酸(HAuC14)溶液中，在-0.2V下電鍍15s，表面沉積金納米粒 子，用于連接目標抗原;得到電極A;
[0031] S3:將電極A在80yL lyg/mL神經元特異性烯醇化酶抗體溶液中浸泡，4°C下放置 12h;隨后用包含0.5 % Tween的0.01M的pH=7.4磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗電極，得到電極B; [0032] S4:37°C下，將電極B在80yL濃度為1 %的牛血清白蛋白溶液(BSA)中浸泡lh，封閉 電極表面非特異性活性位點，之后用含0.5%Tween的0.01M的pH = 7.4磷酸鹽緩沖液對電極 進行清洗，制得基于Ru-Si02@PEI納米粒子構建的免疫傳感器。
[0033] 實施例2
[0034] SI :Ru-Si02@PEI納米粒子溶液的制備：
[0035] 將7.08mL聚乙二醇辛基苯基醚（Triton X-100)、30mL環己烷、7.2mL正己醇和 1.36mL水混合成油包水微乳滴混合液，然后加入320yL·^度為0. lmol/L的聯吡啶釕溶液，攪 拌30min后，依次加入400yL正娃酸乙酯和240yL氨水，持續攪拌24h;反應結束后，向體系中 加入30mL丙酮，靜置30min后，下層沉淀先用乙醇洗四次再用二次蒸餾水洗四次，制得Ru-Si0 2納米粒子，最后將得到的Ru-Si02納米粒子分散到10mL水中備用；
[0036] 取10mL濃度為0 · 5mg/mL上述Ru_Si〇2納米粒子水分散液加入10mL濃度為20mg/mL、 的聚乙烯亞胺(PEI)中，攪拌12h，離心并將所得產物用水洗滌3次，得到Ru-Si0 2@PEI納米粒 子；
[0037] S2:將直徑為3mm的玻碳電極經Al2〇3拋光粉打磨、超純水清洗；取5yL 0.5mg/mL Ru-Si02@PEI納米粒子溶液滴加到電極表面，室溫下晾干；隨后在電極表面滴加2yL質量濃 度0.04%全氟磺酸溶液(Naf ion)，室溫下瞭干，防止Ru-Si〇2@PEI納米粒子從電極上掉落；； 隨后放入質量濃度為1 %的氯金酸(HAuC14)溶液中，在-0.2V下電鍍15s，表面沉積金納米粒 子，用于連接目標抗原;得到電極A;
[0038] S3:將電極A在80yL lyg/mL神經元特異性烯醇化酶抗體溶液中浸泡，4°C下放置 12h;隨后用包含0.5 % Tween的0.01M的pH=7.4磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗電極，得到電極B; [0039] S4:37°C下，將電極B在80yL濃度為1 %的牛血清白蛋白溶液(BSA)中浸泡lh，封閉 電極表面非特異性活性位點，之后用含0.5%Tween的0.01M的pH = 7.4磷酸鹽緩沖液對電極 進行清洗，制得基于Ru-Si02@PEI納米粒子構建的免疫傳感器。
[0040] 實施例3
[0041 ] SI :Ru-Si02@PEI納米粒子溶液的制備：
[0042] 將7.08mL聚乙二醇辛基苯基醚（Triton X-100)、30mL環己烷、7.2mL正己醇和 1.36mL水混合成油包水微乳滴混合液，然后加入320yL·^度為0. lmol/L的聯吡啶釕溶液，攪 拌30min后，依次加入400yL正娃酸乙酯和240yL氨水，持續攪拌24h;反應結束后，向體系中 加入30mL丙酮，靜置30min后，下層沉淀先用乙醇洗四次再用二次蒸餾水洗四次，制得Ru-Si0 2納米粒子，最后將得到的Ru-Si02納米粒子分散到10mL水中備用；
[0043] 取10mL濃度為0 · 5mg/mL上述Ru_Si〇2納米粒子水分散液加入10mL濃度為40mg/mL、 的聚乙烯亞胺(PEI)中，攪拌15h，離心并將所得產物用水洗滌3次，得到Ru-Si0 2@PEI納米粒 子；
[0044] S2:將直徑為3mm的玻碳電極經Al2〇3拋光粉打磨、超純水清洗；取5yL 0.9mg