一種檢測吡蟲啉的化學發光酶聯免疫分析法
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種酶聯免疫檢測試劑盒，尤其涉及一種吡蟲啉的化學發光酶聯免疫檢測試劑盒。
【背景技術】
[0002]卩比蟲啉(imidacloprid),化學名稱1- (6_氯_3_卩比唆基甲基)-N-硝基亞咪唑烷-2-基胺。吡蟲啉具有廣譜殺蟲活性，對飛虱、蚜蟲、葉蟬等刺吸式口器害蟲有特效，對其他種類的害蟲也有良好的防治效果。吡蟲啉是蔬菜種植過程中常用的農藥，對吡蟲啉殘留檢測成為國家對蔬菜類植物中農藥殘留監控的必要手段。日本規定吡蟲啉在蔬菜中的最高殘留限量(MRL)為0.5mg/kg。
[0003]目前，檢測吡蟲啉的方法主要有:高效液相色譜法(HPLC)、色/質聯用分析法(LC-MS)、液/質聯用分析法(LC-MS/MS)。薄層色譜法的缺陷是:操作過程復雜，時間長；操作人員需要經過專業培訓；影響分析的干擾因素較多，結果重復性差。放射免疫法，高效液相色譜法、色/質連用分析法、液/質聯用分析法這些理化方法的缺陷是儀器設備昂貴，樣品前處理復雜，費時，費力，不易普及，檢測費用高，特別是放射免疫法還需要配備放射源，有一定危險性。鑒于此，建立一種有效、快速、簡單、靈敏的檢測蔬菜植物中吡蟲啉含量的方法具有重要意義。
【發明內容】
[0004]本發明的目的是提供一種吡蟲啉的化學發光酶聯免疫檢測試劑盒。該試劑盒具有檢測靈敏度高、應用靈活、方便的特點。
[0005]本發明所述吡蟲啉的化學發光酶聯免疫檢測試劑盒，包括盒體，設在盒體內的酶標板和設在盒體內的吡蟲啉系列標準溶液、酶標羊抗兔抗體、吡蟲啉抗體、發光溶液、洗滌溶液、包被溶液及封閉溶液；其特征在于:
所述酶標板的各孔包被有以吡蟲啉與卵清蛋白偶合制成的包被抗原，其中包被抗原濃度優選10 μ g/mL。
[0006]所述卵清蛋白的分子量范圍優選6.7KDa~6.8KDa。
[0007]所述卩比蟲啉系列標準溶液分別是0mg/kg,0.lmg/kg,0.3mg/kg,0.9mg/kg,
2.7mg/kg和8.lmg/kg所述酶標羊抗兔抗體為辣根過氧化酶-羊抗兔IgG原液,其工作濃度優選為1:1000。
[0008]所述吡蟲啉抗體是由吡蟲啉與分子量范圍是6.7KDa~6.8KDa的牛血清蛋白偶合制成的人工免疫原免疫動物制得的多克隆抗體，其工作濃度優選為1:1000。
[0009]所述發光液是0.0lM魯米諾與0.0OlM對甲苯酚的三(羥甲基)氨基甲烷溶液(pH= 8.8)和3/10000(體積比)H202的混合液。所述魯米諾為發光底物，對甲苯酚為發光增強劑。
[0010]所述洗滌溶液是含有體積分數0.05%吐溫-20的pH7.5,0.lmol/L磷酸鹽緩沖液。
[0011]所述包被溶液是每升水中含1.59g碳酸鈉和2.53g碳酸氫鈉的溶液，pH為9.5。
[0012]所述封閉溶液是每升洗滌溶液中含1g卵清蛋白(OVA，ovalbumin，也稱雞卵清白蛋白或雞卵白蛋白，由386aa組成，分子量約43Kd)且加入重量分數0.5% NaN3的溶液。
[0013]本發明試劑盒最大檢測范圍為0.lmg/kg~8.lmg/kg。
[0014]本發明試劑盒中涉及的吡蟲啉標準溶液、酶標羊抗兔抗體溶液、吡蟲啉抗體溶液、發光溶液及洗滌溶液及其配方對本發明試劑盒檢測的靈敏度影響很大；其中各溶液的主要成分及其配制方法是:
1、批蟲啉標準溶液:以常規方法配制濃度分別為Omg/kg,0.lmg/kg, 0.3mg/kg,
0.9mg/kg, 2.7mg/kg和8.lmg/kg的批蟲啉標準溶液；
2、酶標羊抗兔抗體溶液:酶標羊抗兔抗體為辣根過氧化酶-羊抗兔IgG原液，使用時用洗滌溶液配制成1:1000的工作濃度；
3、吡蟲啉抗體溶液:吡蟲啉抗體是用人工免疫抗原免疫動物制得的多克隆抗體，將所得吡蟲啉抗體用洗滌溶液稀釋成1:1000的工作濃度；
4、發光溶液:是0.0lM魯米諾與0.0OlM對甲苯酚的三(羥甲基)氨基甲烷溶液(pH =
8.8)和3/10000 (體積比)H2O2的混合液；
5、洗滌溶液:指含有體積分數0.05%吐溫-20的pH7.5,0.lmol/L磷酸鹽緩沖液；
6、包被溶液:1.59g碳酸鈉和2.53g碳酸氫鈉溶于IL水中，調節pH為9.5 ;
7、封閉溶液配制:10gOVA溶于IL洗滌溶液中，再加入重量比為0.05%的NaN3。
[0015]本發明所述酶標板的制備:
本發明所述酶標板的包被方法是采用吡蟲啉-OVA在設定的包被溶液中，以設定的濃度，在4°C中過夜反應包被。
[0016]本發明采用的是pH為9.5的碳酸鈉-碳酸氫鈉緩沖溶液。本發明酶標板中所包被的吡蟲啉-卵清蛋白(OVA)在堿性環境下可以很好的結合在微孔板塑料表面上，可以經受多次洗板，采用的包被抗原濃度為10 μ g/mL。
[0017]包被好的酶標板可以用封閉溶液封閉，封閉液中惰性蛋白優選卵清蛋白(OVA)，需加入NaN3防止變質。
[0018]吡蟲啉抗體溶液和酶標羊抗兔抗體溶液的制備:
本發明中吡蟲啉抗體溶液、酶標羊抗兔抗體溶液濃度是決定本發明中萊克多巴胺酶聯免疫測試試劑盒測定范圍及靈敏度的重要因素。
[0019]本發明中涉及的吡蟲啉抗體溶液可以用洗滌溶液配制成濃度為0.Γ8.lmg/kg溶液；或用洗滌溶液稀釋成1:1000的工作濃度。
[0020]本發明中涉及的酶標羊抗兔抗體溶液優選用洗滌溶液配制的濃度為1:1000。
[0021]按照上述吡蟲啉抗體溶液濃度和酶標羊抗兔抗體溶液濃度制備的試劑盒可以達到很好的線性范圍(標準線范圍可以達到0.lmg/kg~8.lmg/kg)及很好的檢測限(0.2mg/
kg) ο
[0022]發光溶液的配制:
本發明采用辣根過氧化酶標記底物發光系統，主要是魯米諾-過氧化氫系統。
[0023]所述發光液是0.0lM魯米諾與0.0OlM對甲苯酚的三(羥甲基)氨基甲烷溶液(pH= 8.8)和3/10000(體積比)H202的混合液。所述魯米諾為發光底物，對甲苯酚為發光增強劑。
[0024]本發明的原理是將抗體-抗原反應的高度特異性與酶催化的高度靈敏性結合起來，利用酶催化底物的化學發光反應檢測產物濃度。
[0025]本發明的化學發光酶聯免疫檢測試劑盒具有靈敏度高、簡便快速、準確的點，與傳統的比色ELISA法比較，靈敏度可以提高一個數量級。有望在農作物產品中的吡蟲啉殘留檢測中發揮重要作用。
【附圖說明】
[0026]圖1為吡蟲啉的標準曲線圖。
【具體實施方式】
[0027]實施例1、免疫原、包被抗原的及抗體的制備 (I)免疫原的合成
將吡蟲啉與牛血清蛋白(BSA)采用對氨基苯甲酸法進行偶聯得到免疫原。具體包括以下步驟:
a、稱取14mg(100 μ mol)對氨基苯甲酸(ABA)溶入1.5mL0.2M鹽酸中，然后稱取
8.3mg(120ymol)的亞硝酸鈉(NaNO2)溶在0.24mL的蒸餾水中，O— 4°C攪拌，將亞硝酸鈉(NaNO2)溶液逐滴加入到對氨基苯甲酸溶液中，避光反應I小時，得溶液A ;
b、稱取34mg(100μ mol)吡蟲啉溶在5mL冰冷的硼砂緩沖(0.05M) (ρΗ8.5，含0.15Μ的NaCl)中，0-4°C攪拌，將上述的A溶液2mL逐滴加入到該溶液中，避光反應2小時，得到桔黃色溶液；
C、把溶液加少量的硼酸晶體調pH至7.4，然后加入136mg(2ymol)CBSA (牛血清白蛋白)，同時加入160mg(834ymol)水溶性碳二亞胺(EDC)，48mg (417 μ mol) N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)，室溫攪拌3小時，得桔黃色溶液；
d、將反應液轉移到半透膜中，在0-4°C用磷酸鹽緩沖溶液(PBS) (0.01M, pH7.4)透析3天，其間每4-6小時換一次透析液；隨后用高純水透析3天，其間每4-6小時換一次透析液；透析完畢，用冷凍干燥機凍干，得桔黃色固體粉末即為免疫原(吡蟲啉與牛血清蛋白的偶聯物)，-20°C保存，備用。
[0028](2)包被抗原的合成
將吡蟲啉與卵清蛋白(OVA)采用I，4-丁二醚法進行偶聯得到包被抗原。具體包括以下步驟:
a.稱取66mg卵清蛋白(OVA)溶于5mL50mM碳酸鹽(ρΗΙΟ.7)緩沖液中，然后向溶液中加入28 μ L (147.9 μ mol)的1，4-丁二醚(BDE)，室溫反應24小時，得溶液A ;
b.稱取76mg(277.Ιμπιο?)吡蟲啉溶于Iml DMF(無水N-N 二甲基甲酰胺)中，再加lmL50mM碳酸鹽(ρΗΙΟ.7)緩沖液中，把溶液A通入氮氣，隨后將吡蟲啉溶液逐滴加入A溶液中，室溫反應24小時，得淡黃色溶液；
c.將反應液轉移到半透膜中，在0-4°C用磷酸鹽緩沖溶液(PBS)(0.01M, pH7.4)透析3天，其間每4-6小時換一次透析液；隨后用高純水透析3天，其間每4-6小時換一次透析液；透析完畢，用冷凍干燥機凍干，得白色固體粉末即為包被抗原(吡蟲啉與卵清蛋白的偶聯物)，-20°C保存，備用。
[0029](3)吡蟲啉多克隆抗體的制備
采用新西蘭大白兔作為免疫動物，以吡蟲啉與分子量范圍是6.7KDa?6.8KDa的牛血清蛋白的偶聯物為免疫原，首次免疫劑量為500 μ g/mL，首免時將免疫原溶于入等體積的生理鹽水和弗氏完全佐劑制成乳化劑，頸背部多點注射，以后免疫取劑量減半的免疫原溶于等體積的生理鹽水和弗氏不完全佐劑混合乳化，首免與二免間隔20天，以后每隔兩周免疫一次共免疫五次，最后一次不加佐劑。最后一次免疫7天以后心臟采血，離心得抗