烘焙食品中2-甲基咪唑和4-甲基咪唑的檢測方法及應用
【技術領域】
[0001 ]本發明涉及一種烘焙食品中2-甲基咪唑和4-甲基咪唑的檢測方法及應用。
【背景技術】
[0002] 甲基咪唑是一種含氮雜環化合物，含一個甲基的甲基咪唑有1-甲基咪唑（1-MEI)、 2-甲基咪唑（2-MEI)和4-甲基咪唑(4-MEI)三種同分異構體，其中2-MEI和4-MEI具有強烈的 致驚厥作用，美國國家毒理學計劃(NTP)通過動物毒理學實驗證明2-MEI和4-MEI具有致癌 性，國際癌癥機構（IARC)將其列為2B組"人類可能的致癌物"。美國加利福尼亞州環境健康 風險評估辦公室(0ΕΗΗΑ)建議4-甲基咪唑的人體日攝入量應小于29 yg。氨法及亞硫酸銨法 生產的焦糖色素是2-MEI和4-MEI的主要來源。中華人民共和國國家標準GB8817-2001規定 了《食品添加劑焦糖色素》中4-MEI的含量不得超過0.02%。此外，2-MEI和4-MEI也存在于未 添加焦糖色素的食品中，但目前還未發現食品中存在另一同分異構體1-MEI。
[0003] 烘焙食品主要包括面包、餅干、糕點等幾大類，隨著生活節奏加快，烘焙食品的需 求量不斷增加，已成為人們生活中不可或缺的食品。烘焙食品中的甲基咪唑來源于兩條途 徑：（1)添加的焦糖色素；（2)熱加工過程中發生的美拉德反應。在世界范圍內，曲奇餅干的 消費量持續攀升，曲奇高糖高脂的配方及高溫焙烤的加工方式十分有利于美拉德反應伴生 危害物的形成，已報道的危害物有丙烯酰胺、晚期蛋白糖基化終末產物等，但尚未見到有關 曲奇中甲基咪唑的研究報告。本發明提供了一種烘焙食品中2-MEI和4-MEI的檢測方法及應 用，以期為烘焙食品中美拉德反應伴生危害物一一甲基咪唑的檢測及其水平控制提供技術 支撐。
[0004] 目前用于檢測食品中甲基咪唑的方法有薄層色譜法、分光光度法、氣/液相色譜法 (GC/LC)、氣相色譜-質譜聯用法(GC-MS)、二維色譜法、酶聯免疫法、高效液相色譜串聯質譜 法(LC-MS/MS)、超高效液相色譜串聯質譜法(UPLC-MS/MS)等。總體上看，薄層色譜法的操作 步驟多且定量不準確;分光光度法受基質干擾嚴重，測定結果偏差大;GC和GC-MS法的樣品 前處理較為繁瑣，且需要衍生化;ELISA法容易受到雜質的干擾，易產生假陽性;LC-MS/MS及 UPLC-MS/MS法，樣品的前處理方法主要有QuEChERS試劑盒、離子對萃取、固相萃取、超臨界 流體萃取、陽離子交換吸附等，采用這些凈化方法雖然可以減少干擾，提高靈敏度，但卻增 大了檢測工作量和測試成本，并且目前方法都未考慮到同分異構體1-MEI可能對檢測的干 擾。
【發明內容】
[0005] 本發明的目的在于提供一種烘焙食品中2-甲基咪唑和4-甲基咪唑的檢測方法及 應用。本發明的目的是通過如下技術方案來實現的： 烘焙食品中2-甲基咪唑(2-MEI)和4-甲基咪唑(4-MEI)的檢測方法，其包括如下步驟： 1)在樣品加入三氯乙酸和甲醇混合溶液以沉淀蛋白質及膠質等雜質，超聲提取，定容， 提取液經離心、過濾得到待測溶液； 2)將步驟1)得到的待測液用CAPCELL CR(1:4)色譜柱(5 μπι，2.0 mmX150 mm)分離，采 用同位素稀釋超高效液相色譜串聯質譜法對烘焙食品中2-MEI和4-MEI成分進行定性和定 量分析。
[0006] 所述步驟1)具體為:稱取研磨粉碎后的待測樣品（3 g)于25 mL具塞比色管中，加 入10 mL質量百分比為5%的三氯乙酸(含體積百分比為20%的甲醇）溶液，渦旋震蕩混勻，超 聲波震蕩提取30 min，用去離子水定容，混勾，提取液于16000 r/min離心3 min，取上清液 過0.22 μπι的PTFE膜過濾到進樣瓶中，得到待測溶液。
[0007] 所述步驟2)分析方法色譜條件為:采用CAPCELL CR(1:4)色譜柱(5 μπι，2.0 mmX 150 mm);流動相:A相為20 mmol/L乙酸銨(含體積百分比為0.0067%的甲酸），B相為甲醇， 梯度洗脫：0.0-0.5 min，70-25% Α;0·5-3·0 min，25% Α;3·0-6·0 min，70% A; 6.0-8.0 min，70% Α;流速:400 yL/min，柱溫:35°C;進樣量：10 yL;分析方法質譜條件為：電離源為 電噴霧正離子模式(ESI + );多反應監測（MRM);特征離子：1_甲基咪唑（1-ΜΕΙ)母離子為 83.0，定量子離子42.0，定性子離子56.0; 2-MEI母離子83.0，定量子離子42.0，定性子離子 56.0 ; 4-MEI母離子83.0，定量子離子56.0，定性子離子42.0; 4-MEI-d5同位素內標母離子 88.0，子離子60.0;采用氘代4-MEI同位素標準品為內標，進行2-MEI和4-MEI含量測定。
[0008] 本發明針對現有LC-MS/MS及UPLC-MS/MS檢測方法中存在的樣品前處理繁瑣、成本 高等不足，提供一種前處理簡單、快速準確、低成本并能有效分離1-MEI、2-MEI和4-MEI三種 同分異構體的烘焙食品中2-MEI和4-MEI的檢測方法。與現有技術相比較，本發明具有以下 突出優點： 1、采用CAPCELL CR(1:4)色譜柱，增強了目標化合物的保留，使同分異構體1 -MEI、2-MEI和4-MEI及其它雜質分離完全，有效降低了離子抑制效應，提高了靈敏度，檢測限低、準 確性好。
[0009] 2、本方法無需固相萃取等復雜的樣品前處理程序，能有效分離甲基咪唑的三種同 分異構體并有效降低了離子抑制效應，提高了靈敏度，具有檢測限低、準確性好的優點。 [0010]本方法采用三氯乙酸沉淀樣品中的蛋白，加入甲醇使膠質等雜質沉淀，易于獲得 澄清溶液，避免了固相萃取等前處理造成的目標化合物的損失，大大提高了檢測效率，節約 了成本，同時降低了實驗人員因前處理過程中使用毒性試劑所面臨的健康威脅。
【附圖說明】
[0011] 圖1為l-MEI、2-MEI和4-MEI標準品的一級質譜圖； 圖2為1-MEI、2-MEI和4-MEI標準品的二級質譜圖； 圖3為4-MEI-d5標準品的一級質譜圖； 圖4為4-MEI-d5標準品的二級質譜圖； 圖5為1-MEI、2-MEI和4-MEI標準品的色譜圖； 圖6餅干中2-MEI和4-MEI的色譜圖。
【具體實施方式】
[0012] 以下結合實施例對本發明作進一步說明。（但不是對本發明的限制）。
[0013] 本發明提供的烘焙食品中2-MEI和4-MEI的檢測方法包括如下步驟： 1) 直接在樣品加入三氯乙酸和甲醇混合溶液以沉淀蛋白質及膠質等雜質，超聲提取， 定容，提取液經離心、過濾得到待測溶液； 2) 將經步驟1)得到的待測液采用CAPCELL CR(1:4)色譜柱(5 μπι，2.0 mmX150 mm)進 行分離，同位素稀釋超高效液相色譜串聯質譜法對烘焙食品中2-MEI和4-MEI進行定性和定 量分析。
[0014]本發明的烘焙食品中2-MEI和4-MEI的檢測方法，具體為:稱取研磨粉碎后的待測 樣品（3 g)于25mL具塞比色管中，加入10 mL質量百分比為5%的三氯乙酸(含體積百分比為 20%的甲醇)溶液，渦旋震蕩混勻，超聲波震蕩提取30 min，用去離子水定容，混勻，提取液于 16000 r/min離心3 min，取上清液過0.22 μπι的PTFE膜過濾到進樣瓶中得到待測溶液。 [0015] 所述的烘焙食品中2-ΜΕΙ和4-ΜΕΙ檢測方法的色譜條件為:采用CAPCELL CR( 1:4) 色譜柱（5 μηι，2·0 mmX150 mm);流動相：A相為20 mmol/L乙酸銨（含體積百分比為 0.0067%的甲酸），8相為甲醇;梯度洗脫:0.0-0.5 11^11，70-25%八;0.5-3.0 11^11，25%八;3.0-6.0 min，70% A; 6.0-8.0 min，70% A;流速:400 yL/min，柱溫：35°C;進樣量：10 yL。質譜 條件為：電離源為電噴霧正離子模式(ESI+)，多反應監測(MRM);特征離子：1-MEI的母離子 為83.0，定量子離子42.0，定性子離子56.0; 2-MEI的母離子為83.0，定量子離子42.0，定性 子離子56.0; 4-MEI的母離子為83.0，定量子離子56.0，定性子離子42.0; 4-MEI-d5同位素內 標的母離子為88.0,子離子60.0;采用氘代4-MEI同位素標準品為內標，進行2-MEI和4-MEI 的含量測定。
[0016] 所述的烘焙食品中2-MEI和4-MEI檢測方法涉及的檢測儀器、耗材及化學試劑、標 準品有:超高效液相色譜串聯四級桿質譜儀，配電噴霧離子源(ESI);離心機(轉速2 10000 r/min)、渦旋混合器、分析天平、組織搗碎機、移液器；色譜柱：CAPCELL CR( 1: 4)，5 μπι， 2.0mmX 150 mm; 1-ΜΕΙ、2-ΜΕΙ和4-MEI標準品，氘代4-MEI標準品；乙腈(色譜純）、甲醇(色 譜純）、超純水等;其他試劑均為分析純。
[0017] 所述的檢測條件： 液相條件：采用CAPCELL CR(1:4)色譜柱（5 ym，2.0mmX150 mm);流動相:A相為20 mmol/L乙酸銨(含體積百分比為0.0067%的甲酸），B相為甲醇，梯度洗脫:0.0-0.5 min，TOSS% Α;0·5-3·0 min，25% Α;3·0-6·0 min，70% A; 6.0-8.0 min，70% A。流速 ：400 yL/min， 柱溫:35°C，進樣量:10 yL。
[0018] 質譜條件：電離源為電噴霧正離子模式(ESI+);多反應監測(MRM);毛細管電壓3.50 KV;源溫度120°C;脫溶劑氣溫度400°C;脫溶劑氣流量700 L/h，碰撞室壓力：2.7x10-3 mbar， 特征離子及其它質譜參數見表1，采用氖代4-MEI標準品為內標，進行2-MEI和4-MEI的含量 測定。
[0019] 表1 2-MEI、4-MEI和4-MEI-d6的質譜分析條件
注:*為定莖尚子 具體地，本發明所述待測樣品中2-MEI和4-MEI的檢測方法包括以下幾個過程： (1)標準溶液的配制 1) 1 -MEI、2-MEI和4-MEI標準儲備溶液:準確稱取適量的1 -MEI、2-MEI和4-MEI標準 品，用乙腈溶解后并定容于容量瓶中，分別配成配制成濃度為532.5 yg/mL、843.9 yg/mL和 568.6 yg/mL的標準儲備溶液，置于4°C冰箱中保存。
[0020] 2)同位素內標標準儲備溶液:準確稱取適量的氘代4-MEI標準品，用乙腈配制成 1768.7 yg/mL的標準儲備溶液，置于4°C冰箱中保存。
[0021] 3H-MEI、2-MEI和4-MEI標準使用溶液:根據需要，臨用時吸取一定量的1-MEI、 2-MEI和4-MEI標準儲備溶液，用20%乙腈稀釋配制成標準使用溶液，置于4°C冰箱中保存。 [0022] 4)同位素內標標準工作溶液:根據需要，臨用時吸取一定量的同位素內標標準儲 備溶液，用20%乙腈進行適當稀釋，配制成同位素內標標準工作溶液，置于4°C冰箱中保存。
[0023] (2)確定檢測的標準 1) 定性檢測標準:每種化合物的質譜定性離子必須出現，至少應包括1個母離子，2個子 離子，而且同一檢測批次，對同一化合物，樣品中目標化合物的兩個子離子的相對豐度比與 濃度相當的標準溶液譜圖中對應的定性離子的