一種檢測動物源食品中甲巰咪唑殘留的酶聯免疫試劑盒及其應用
【技術領域】
[0001] 本發明涉及酶聯免疫檢測技術，具體涉及一種檢測甲琉咪哇的酶聯免疫試劑盒， 其特別適用于動物源食品中甲琉咪哇殘留的檢測。 技術背景
[0002] 甲琉咪哇是甲亢的常用治療藥物，能改變動物體內的內分泌，動物在飼用含甲琉 咪哇的飼料后，在尿液、雞肉和組織中會有不同程度的殘留，歐盟等國家已明確將其列入動 物園食品中禁用藥物。目前，激素類物質已被大部分國家禁止在養殖業中使用，并不得在食 品中檢出。但國內對畜產品中甲琉咪哇等違禁藥物殘留的檢測幾乎是空白，根據我國對動 物源產品殘留監控規定及有關進口國的要求，研究各種檢測方法已成為當務之急。
[0003] 目前，檢測甲琉咪哇殘留量的方法主要是高效液相色譜法（HPLC)，由于復雜的儀 器設備和繁瑣的過程W及對檢驗人員的高技能要求，不適合現場監控和大量樣本的篩查。
【發明內容】
[0004] 本發明的目的在于針對上述不足提供一種用于動物源食品中甲琉咪哇殘留檢測 酶聯免疫試劑盒，其操作簡單適合現場大批量樣品的篩選。
[0005] 本發明試劑盒，它含有： (1) 包被有包被原的酶標板（包被原為抗原、抗體或抗抗體）； (2) 酶標記物（為酶標記半抗原、酶標記抗體或酶標記抗抗體）； (3) 甲琉咪哇抗體工作液（當酶標板上包被抗原且酶標記物為酶標記抗抗體或酶標板 上包被抗抗體且酶標記物為酶標抗原時含有）； (4) 甲琉咪哇標準品溶液； (5) 底物顯色液； (6) 終止液； (7) 濃縮洗涂液； (8) 濃縮復溶液； 本發明提供的檢測甲琉咪哇殘留量的酶聯免疫試劑盒，包括甲琉咪哇特異性抗體工作 液及預包被包被原的酶標板和酶標記物工作液，所述酶標記物為酶標記的抗抗體，酶標記 甲琉咪哇半抗原或酶標記甲琉咪哇特異性抗體；所述抗抗體為羊抗鼠抗抗體或羊抗兔抗抗 體。
[0006] 所述酶標記物的標記酶為辣根過氧化物酶，酶標記的羊抗鼠抗抗體是采用混合 酸酢或碳化二亞胺法將標記酶與抗抗體進行偶聯得到的。
[0007] 所述甲琉咪哇特異性抗體為甲琉咪哇單克隆抗體，他們均是用甲琉咪哇半抗原與 載體蛋白采用混合酸酢法得到的偶聯物作為免疫原得到的，所述甲琉咪哇單克隆抗體優選 甲琉咪哇鼠單克隆抗體。
[0008] 為了更方便現場監控和大量樣本篩查，所述試劑盒還包括甲琉咪哇標準品溶液、 顯色劑、終止液、濃縮洗涂液、濃縮復溶液。
[000引所述洗涂液優選濃縮洗涂液為抑7.廣17. 7,含有0. 8%~1. 2%吐溫80和 0. 03^10. 05%硫柳隸防腐劑，0. 02^10. 04mol/L磯酸鹽緩沖液，所述百分比為重量體積百分 比。
[0010] 當酶標記物的標記酶為辣根過氧化物酶，底物顯色液A為過氧化氨或過氧化脈， 底物顯色液B為鄰苯二胺或四甲基聯苯胺，終止液為廣2mol/L硫酸或鹽酸緩沖液； 所述復溶液為含有0.08~10. 12%吐溫20、3~18%卵清蛋白、0.2~0.5mol/L磯酸鹽緩沖 液，所述百分比為重量體積百分比。 本發明中酶標板的制備過程為用緩沖液將包被原稀釋成0. 2^0. 3 μ g/ml，每孔加入 100 μ L 37°C溫育化或4°C過夜，傾去包被液，用稀釋后的洗涂液洗涂兩次，每次30s，拍干， 然后在每孔中加入150~200 μ L封閉液，37°C溫育廣化，傾去孔內液體拍干，干燥后用鉛膜 真空密封保存。
[0011] 本發明中抗原的合成過程： 1. 半抗原的合成 甲琉咪哇半抗原是將孕麗和玻巧酸酢通過反應得到的 2. 甲琉咪哇抗體的制備 將甲琉咪哇半抗原與載體蛋白采用碳化二亞胺法進行偶聯得到免疫原 本發明所述試劑盒中甲琉咪哇標準品溶液；標注品溶液6瓶，為0 μ g/l，0. 3 μ g/l， 0. 9 μ g/L, 2. 7 μ g/L, 8. 1 μ g/L, 24. 3 μ g/L〇
[0012] 本發明的檢測原理為： 當在微孔條上預包被甲琉咪哇抗原時，加入樣本溶液或標準品溶液后，隨即加入酶標 二抗，再加入甲琉咪哇特異性抗體溶液，樣本中殘留的甲琉咪哇與酶標板上包被的甲琉咪 哇抗原競爭孕麗特異性抗體，酶標記抗抗體進行放大作用，用顯色液顯色，樣本吸光值與甲 琉咪哇的含量成負相關，與標準曲線比較可粗略判斷樣品中甲琉咪哇殘留量的濃度范圍。
[0013] 本發明還提供了一種應用上述酶聯免疫試劑盒檢測動物源食品中甲琉咪哇殘留 的方法，它包括步驟： (1) 樣品前處理； (2) 用試劑盒進行檢測； (3) 分析檢測結果。
[0014] 樣本前處理主要是為了從樣本中獲得甲琉咪哇溶液，從而用于后續的檢測。樣本 前處理的方法： 稱取2. 0+(-)0. 5牛肉至50ml聚苯己帰離必管中，加入5~8ml己酸己醋，振蕩器振蕩 10min，3000r W上離必5min，取上清液廣3ml，至10ml干凈的玻璃試管中，于50~6(TC水浴 氮氣流下吹干，加入廣3ml樣本復溶液，用潤旋儀潤旋Imin，取50 μ 1用于分析。
[0015] 本發明中用試劑盒檢測時，當包被原為甲琉咪哇抗原時，向酶標板微孔中加入標 準品溶液或樣本溶液，隨即加入酶標二抗，再加入抗體工作液，溫育后洗涂拍干，顯色，終 止，用酶標儀測定吸光度值。本發明中的結果分析過程為：用所獲得的每個濃度的標準品溶 液的吸光度平均值度）除W第一個標準品溶液（0標準）的吸光度值度0)再乘W 100%，即 百分吸光度值，計算公式為： 百分吸光度值餅)=度/B0)X100% W甲琉咪哇標準品的濃度（μ g/L)的半對數值為X軸，百分吸光度值為Y軸，繪制標準 曲線圖，用同樣的辦法計算樣品中的百分吸光度值，相對應的每個樣品的濃度則可從標準 曲線上讀出樣本中甲琉咪哇的殘留量。
[0016] 本發明中檢測結果的分析也可W采用回歸方程法，計算出樣品溶液的濃度。
[0017] 本發明中檢測結果的分析還可W利用計算機軟件，此法更便于大量樣品的快速分 析，整個檢測過程只需不足比可W完成。
[0018] 本發明檢測動物源食品中甲琉咪哇殘留的酶聯免疫試劑盒主要采用間接競爭 ELISA方法定性或定量檢測出樣品中的甲琉咪哇的殘留量，對樣品前處理要求低，樣品前處 理過程簡單，能同時快速檢測出大批量樣品，主要試劑W工作液的形式提供，檢驗方法方便 易行，具有特異性高，靈敏度高，精確度高，準確度高等特點。本發明的酶聯免疫試劑盒結構 簡單，使用方便，攜帶便利，檢測方法高效準確，適于大批量樣品篩選檢測。本發明的試劑盒 將在甲琉咪哇殘留的檢測中發揮重要作用。
【附圖說明】
[0019] 圖1甲琉咪哇化學結構通式。
[0020] 圖2甲琉咪哇試劑盒的標準曲線。
【具體實施方式】
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