一種定量分析殼聚糖的共振瑞利散射法
【技術領域】
[0001] 本發明設及檢測技術領域，更具體地，設及一種定量分析殼聚糖的共振瑞利散射 法。
【背景技術】
[0002] 殼聚糖(CTS)是甲殼素脫乙酷基產物，其化學名稱為聚葡萄糖胺（1,4)-2-氨基-2-脫氧-D-葡聚糖，是自然界含量僅次于纖維素的第二大天然有機高分子化合物。它是甲殼類 (郵、蟹）動物、昆蟲的外骨骼的主要成分。殼聚糖及其衍生物是重要的生物活性物質，具有 抗腫瘤，抗凝血，減肥降脂和增強免疫力等功能，可作為醫藥保健品、食品、化妝品等的添加 劑及制備人造皮膚和手術縫合線等的重要原料。因此，殼聚糖在生物醫學，環境衛生和食品 等領域都有著廣闊的應用前景。
[0003] 隨著殼聚糖廣泛應用，殼聚糖的準確定量顯得十分重要。目前，國內外用于殼聚糖 定量分析的方法主要集中在分光光度法和巧光法。目前，光譜法測定殼聚糖普遍忽略了殼 聚糖作為高分子天然產物，其分子量從幾千到百萬不等，當樣品中殼聚糖分子量與標準品 差異較大時，可能會產生一定的系統誤差，影響準確測定。
【發明內容】
[0004] 本發明為了克服現有技術的上述不足，提供活性紅4在作為定量分析殼聚糖的探 針中的應用。
[000引本發明的另一個目的是提供一種W活性紅4為探針的定量分析殼聚糖的方法。
[0006] 本發明的再一個目的是提供一種定量分析殼聚糖的共振瑞利散射法。
[0007] 為了實現上述目的，本發明是通過W下方案予W實現的： 本發明首先研究了弱酸環境下活性紅4與殼聚糖締合后的光譜特征，及其在殼聚糖定 量分析中的應用。結果表明在弱酸性B-R緩沖體系中，活性紅4與殼聚糖的離子締合物于λ= 342nm處產生強烈的共振瑞利散射特征峰，共振瑞利散射強度與殼聚糖濃度C呈良好線性關 系，在0.050 ~6.00yg/mL 的濃度范圍內，線性方程為：ΔΙ = 682.31C+ 114.95(c，yg/mL)， R2=0.9991，檢測限0.03化g/mL。據此，本發明要求保護活性紅4在作為定量分析殼聚糖的探 針中的應用。
[0008] 另外，本發明還保護一種W活性紅4為探針的定量分析殼聚糖的方法。
[0009] -種定量分析殼聚糖的共振瑞利散射法，包括W下步驟： 標準曲線的繪制:配置η個成梯度濃度的殼聚糖溶液和1個空白試劑，向η個成梯度濃度 的殼聚糖溶液和1個空白試劑中分別加入2倍體積的B-R緩沖溶液，然后再分別加入等體積 的活性紅4溶液，混合均勻后得到稀釋后的成濃度梯度的殼聚糖待測溶液，靜置，檢測殼聚 糖待測溶液的共振瑞利散射強度，具體為Κλθχ=λθπι進行同步掃描，記錄RRS光譜，并于 342nm處分別測量離子締合物的Irr沸試劑空白的1〇,繪制標準曲線，進一步得線性方程：Δ I = 682.31C+ 114.95(c，yg/mL) 式中 Δ I = Irrs-Io; 樣品檢測：向經過初步處理后的待測樣品的上清液中，加入2倍體積的B-R緩沖溶液，然 后再加入等體積的活性紅4溶液，混合均勻后靜置，檢測共振瑞利散射強度，由上述線性方 程計算出待測樣品中殼聚糖的濃度。 優選地，所述靜置的時間為120分鐘W內。
[0010] 優選地，所述棘性紅4溶液的濃度化.00乂1〇-4111〇1/1，8-1?緩沖溶液的抑為5.5。
[0011] 優選地，待測樣品初步處理的步驟如下:將待測樣品用0.5mol/L的醋酸溶液溶解， 待完全溶解后離屯、，得上清液，上清液稀釋后用于巧光巧滅檢測。
[0012] 更優選地，一種定量分析殼聚糖的共振瑞利散射法，包括W下步驟： 標準曲線的繪制:在一系列10.OOmL的比色管中，按先后順序分別加入ImL濃度分別為 0.5、1、3、5、10、20、30、40、50、60yg/mL的殼聚糖溶液，P冊.50的B-R緩沖液緩沖液2. OOmL， 1.00 X l(T4mol/L活性紅4操作液1 .OOmL，W蒸饋水稀釋至刻度線，搖勻得到濃度分別為 0.05、0.10、0.30、0. 50、1.00、2. 00、3.00、4, 00、5.00、6.00yg/mL的殼聚糖待測溶液，靜 置15~120分鐘，WAex=Aem進行同步掃描，記錄RRS光譜，并于34化m處分別測量離子締合 物的Irrs和試劑空白的1〇,繪制標準曲線，進一步得線性方程：ΔΙ = 682.31C+ 114.95(c，y g/mL) 式中 Δ I = Irrs-Io; 樣品檢測：將〇.4g待測樣品用0.5mol/L的醋酸溶液溶解，定容至lOOmL，待完全溶解后 離屯、，取2.5mL上清液，并定容至lOOmL，作為樣品操作液，取1血樣品操作液，加入2mL的抑為 5.5的B-R緩沖溶液，再加入1血的1.00 X l〇-4mol/L活性紅4溶液，用水定容至10血，混合均勻 后，靜置15~120分鐘，檢測共振瑞利散射強度，由線性方程計算出待測樣品中殼聚糖的濃 度。與現有技術相比，本發明具有如下有益效果： 本發明首次研究了弱酸環境下活性紅4與殼聚糖締合后的光譜特征，及其在殼聚糖定 量分析中的應用。研究結果顯示，在弱酸性B-R緩沖體系中，活性紅4與殼聚糖的離子締合物 于λ=342ηπι處產生強烈的共振瑞利散射特征峰，共振瑞利散射強度與殼聚糖濃度C呈良好線 性關系，在0.050~6.00yg/mL的濃度范圍內，線性方程為：ΔΙ = 682.31C+ 114.95(c，yg/ mL)，R2=0.9991，檢測限0.03化g/mL。據此本發明利用殼聚糖與活性紅4的結合，建立了分析 殼聚糖的共振瑞利散射，該方法具有操作簡單，快速，準確，靈敏度高等特點。
【附圖說明】
[0013] 圖1為紫外吸收光譜、巧光光譜W及共振瑞利散射光譜。
[0014] 圖2為不同濃度殼聚糖的共振瑞利散射圖譜；1.殼聚糖（2.Oyg /mL);2.活性紅4 (1.0Xl〇-5mol/L); 3~7.活性紅4 (1.0Xl〇-5mol/L)-殼聚糖（1.0，2.0，3.0，4.0， 5.化g /mL)復合物。
[001引圖3為活性紅濃度的影響。
[0016] 圖4為緩沖溶液用量的影響。
[0017] 圖5為低、中、高分子量殼聚糖的標準曲線W及模擬樣品曲線；（)低分子量；（?) 中分子量;（▲)高分子量;（▼)中分子量模擬樣品。
【具體實施方式】
[0018] 下面結合說明書附圖和具體實施例對本發明作出進一步地詳細闡述，所述實施例 只用于解釋本發明，并非用于限定本發明的范圍。下述實施例中所使用的試驗方法如無特 殊說明，均為常規方法;所使用的材料、試劑等，如無特殊說明，為可從商業途徑得到的試劑 和材料。
[0019] 殼聚糖（CTS)標準（20°C時，1%溶解在1%醋酸溶液中）：低分子量為< 200 mPa. S;中分子量為200~400mPa. S;高分子量為400~lOOOmPa. S。殼聚糖(CTS)標準溶液:配 置方法為準確稱取0.0400g殼聚糖溶于0.5mol/L醋酸溶液中，于容量瓶定容至lOOmL，得到 濃度為400.化g/mL的標準膽備液;吸取儲備液2.50mL于100 mL的容量瓶中，W水定容到刻 度，得到10.0化g/mL的殼聚糖標準溶液，現配現用。
[0020] 活性紅4操作液（1.00 X l〇-4mol/L):精密稱取0.0250g活性紅4(Sigma公司）染料， 用水溶解，于250mL容量瓶中定容，搖勻，備用。
[0021 ] Britton-Robinson(B-R)緩沖溶液：由0.04mol/L 混合酸[(2.71mL正憐酸 + 2.36mL冰乙酸+2.47g棚酸)/L]與0.2mol/L NaOH溶液按不同比例配制而成。
[0022] 實施例1 一、光譜分析:在lOmL的比色管中，加入ImL殼聚糖標準溶液