蠶豆葉片蛋白質組學分析的樣品制備方法

蠶豆葉片蛋白質組學分析的樣品制備方法
【技術領域】
[0001] 本申請屬于生物化學，具體地說，設及一種蠶豆葉片蛋白質組學分析的樣品制備 方法。
【背景技術】
[0002] 隨著人類基因組計劃的全面實施與推進，生命科學已經進入了后基因組時代，其 主要研究對象已轉變為功能基因組學的研究。
[0003] 蛋白質組學(Proteomics) W活細胞內基因組編碼的全部蛋白質為研究對象，是研 究生物體在特定時間或特定空間內所表達的全部蛋白質的特征，包括蛋白表達水平，翻譯 后修飾，蛋白質與蛋白質或與其他生物分子的相互作用等，是掲示植物與環境之間相互作 用分子機制的一種新手段，其研究被認為是后基因組時代生命科學研究的核屯、內容之一且 日趨成為研究熱點而備受關注。
[0004] 雙向電泳（two-dimensional electro地oresis，2-DE)可W對生物細胞或組織全 蛋白質表達進行定性或定量的綜合分析，尤其是用于掲示不同條件下蛋白質表達的變化。 作為蛋白組學研究中的核屯、技術之一，是對蛋白質組分辨率最高、重復性最好的分離技術， 也是目前常用的唯一一種能夠連續在一塊膠上分離數千種蛋白質的方法，廣泛應用于生物 學研究的各個方面。然而雙向電泳步驟繁瑣，影響因素較多，蛋白質樣品的制備是雙向電泳 的第一步，也是最重要的一步，樣品制備的好壞直接影響到隨后蛋白的分離及最后分析結 果的可靠性。目前并沒有一個通用的制備方法，樣品制備方法要根據不同實驗材料進行選 擇，不同的材料所適用的方法也不同。樣品制備分為蛋白質的提取、裂解液配方的選擇、雜 質的去除等步驟，在處理某種樣品的時候，如果運些步驟中的任何一步沒有充分完成，分離 可能不完全或失敗，并且，一些信息也可能丟失。因此建立有效的樣品制備方法，高分辨地 分離蛋白質一直是植物蛋白質組學研究中雙向凝膠電泳技術不斷改進的方向。
[0005] 雙向電泳技術早期主要應用于細菌、動物組織和細胞全蛋白質組分的分析，近年 來在植物中的應用亦有不少報道，但大多集中于水稻、小麥等模式植物或其它一些草本植 物上，在豆科植物中報道較少，研究多集中在油料作物大豆、牧草植物黃花首猜、截形首猜、 菜飼兼用作物魏豆等植物上，但設及蠶豆蛋白質組的研究鮮見報道。
[0006] 蠶豆能適應冷涼氣候和多種±地條件，與根瘤菌形成固氮共生體為自身和后作作 物提供無償可利用的氮源，有生物固氮之王的美譽，具有高蛋白含量，易消化吸收，糧、飼、 菜兼用和深加工增值等特點，是種植業結構調整中重要的間套作和養地作物。蠶豆關于蛋 白方面研究起步較晚，主要研究集中在食品加工級別的蛋白提取、分離、功能特性研究等方 面，而在蛋白質組學方面只有理論綜述，而沒有實質性的工作進展。開展蠶豆蛋白質組學研 究對于深入研究蠶豆生長發育機理，抗逆性研究、遺傳育種都具有重要的理論意義和實用 價值。因此，為了加快蠶豆蛋白質組學研究步伐，為蠶豆蛋白質組學研究奠定理論基礎和技 術指導需要盡快著手建立一種適合于蠶豆蛋白質組學分析的樣品制備方法，為深入開展蠶 豆蛋白質組學研究提供技術支撐，邁出開展蠶豆雙向電泳技術的第一步。

【發明內容】

[0007] 有鑒于此，本申請所要解決的技術問題是現有技術中沒有通用、有效、適合于蠶豆 的蛋白質組學分析樣品的制備方法。提供一種適合蛋白質組學分析的蠶豆葉片樣品制備方 法。
[0008] 為了解決上述技術問題，本申請公開了一種蠶豆葉片蛋白質組學分析的樣品制備 方法，包括W下步驟：
[0009] 1)取新鮮蠶豆幼苗葉片。
[0010] 2)將所述新鮮蠶豆幼苗葉片用液氮快速冷卻并研磨成粉末。
[0011] 3)向步驟2)所述粉末中加入提取緩沖液，滿旋混勻后-20°c過夜沉淀，過夜后的樣 品棄去沉淀，取上清液離屯、，離屯、后棄去上清液，得到沉淀。
[0012] 4)向步驟3)得到的沉淀中加入含0.07%β-琉基乙醇的-20°c預冷丙酬溶液，搗碎 沉淀，使所述沉淀與丙酬溶液充分接觸，然后將沉淀滿旋混勻，靜置，然后離屯、，棄去上清 液，得到沉淀。為了盡可能地去除蛋白沉淀中的干擾物質，得到符合雙向電泳要求的蛋白質 樣品，可重復此步驟1次。
[0013] 5)向步驟4)得到的沉淀中加入含0.07 %β-琉基乙醇的-20°C預冷的90 %丙酬溶 液，滿旋混勻后搗碎沉淀，靜置，然后離屯、，棄去上清液，得到沉淀。為了盡可能地去除蛋白 沉淀中的干擾物質，得到符合雙向電泳要求的蛋白質樣品，可重復此步驟1次。
[0014] 6)將步驟5)得到的沉淀干燥，得到粉末。
[0015] 7)向所述粉末中加入裂解液，23°C靜置2.化，然后滿旋混勻，得到樣品裂解溶液。
[0016] 8)將步驟7)得到的樣品裂解溶液離屯、，吸取上清液，將所述上清液再次離屯、，取上 清液作為待分析溶液。
[0017] 9)繪制蛋白濃度標準曲線，取待分析溶液與考馬斯亮藍蛋白試劑反應，測定吸光 度值，根據所述蛋白濃度標準曲線計算得到待分析溶液中蛋白質的濃度。
[0018] 10)按電泳上樣量9(K)yg，計算蛋白體積，并分裝到化1的小管中，然后于-80°c保 存；
[0019] 蛋白體積(μ1 )= 90化g/待分析溶液中蛋白質濃度。
[0020] 11)從-80°c取出蛋白樣品，自然融化后按上樣總體35化1和蛋白體積，計算出水化 液體積，加入蛋白樣品水化液，在4°C、12000 X g下離屯、15min，即得；
[0021] 水化液體積=35化^蛋白體積。
[0022] 進一步的，所述步驟2)中，將新鮮蠶豆幼苗葉片用液氮快速冷卻后置于-20°C預冷 后的研鉢中研磨。
[0023] 進一步的，步驟3)中，所述提取緩沖液為含0.07%β-琉基乙醇的10%Ξ氯乙酸丙 酬溶液;所述提取緩沖液加入前先進行預冷;所述離屯、條件為4°C、20000 X g下離屯、20min。
[0024] 進一步的，步驟4)中，所述靜置條件為-20°C條件下靜置20min;所述離屯、條件為4 °C、20000Xg下離屯、20min。
[0025] 進一步的，步驟5)中，所述靜置條件為-20°C條件下靜置20min;所述離屯、條件為4 °C、20000Xg下離屯、20min。
[00%]進一步的，步驟6)中，所述干燥方法為真空干燥化;所述粉末為乳白色。
[0027] 進一步的，步驟7)中，所述裂解液為8mol/L尿素、2%聚乙二醇辛基苯基酸(Triton X-100)和60mol/L二硫蘇糖醇(DTT)的混合溶液;所述裂解液加入體積與所述新鮮蠶豆幼苗 葉片質量比為1:1。
[0028] 進一步的，步驟8)中，所述離屯、條件為4°C、12000 X g下離屯、15min;再次離屯、條件 為 4°C、12000Xg下離屯、lmin。
[0029] 進一步的，步驟9)中，所述蛋白濃度標準曲線W牛血清蛋白為標準蛋白，參考 化a壯ord的方法繪制。
[0030] 進一步的，所述考馬斯亮藍蛋白試劑包括：質量濃度為0.01 %的考馬斯亮藍G-250，質量濃度為4.75 %的乙醇和質量濃度為8.5 %的憐酸;所述反應時間為5min，檢測波長 為595nm。
[0031] 進一步的，所述蛋白樣品水化液包括:7mol/L尿素，2mol/L硫脈，4%的3-3-膽酷胺 基丙基二甲基錠基-1-丙橫酸鹽(CHAPS)，65mmol/L二硫蘇糖醇(DTT)，0.2%載體兩性電解 質αPGbuffer)和0.001%漠酪藍。
[0032] 與現有技術相比，本申請可W獲得包括W下技術效果：
[0033] 1)本申請W蠶豆葉片為實驗材料，W獲得符合蛋白質組學分析的樣品制備方法為 目的，填補了蠶豆葉片雙向電泳技術的空白，為深入開展蠶豆蛋白質組學提供技術支持。
[0034] 2)本申請的技術方案，步驟簡單，易于操作，重復性好，技術人員易學、易掌握。
[0035] 3)本申請中選用的實驗試劑均為雙向電泳常規試劑，無昂貴、稀有試劑，實驗運作 成本低。
[0036] 當然，實施本申請的任一產品必不一定需要同時達到W上所述的所有技術效果。
【附圖說明】
[0037] 此處所說明的附圖用來提供對本申請的進一步理解，構成本申請的一部分，本申 請的示意性實施例及其說明用于解釋本申請，并不構成對本申請的不當限定。在附圖中：
[0038] 圖1為本申請蠶豆葉片蛋白質組學分析的樣品制備方法實施例1的蛋白濃度標準 曲線圖；
[0039] 圖2為本申請蠶豆葉片蛋白質組學分析的樣品制備方法實施例1得到的蛋白樣品 的2-DE電泳圖。
【具體實施方式】
[0040] W下將配合附圖及實施例來詳細說明本申請的實施方式，藉此對本申請如何應用 技術手段來解決技術問題并達成技術功效的實現過程能充分理解并據W實施。
[0041] 實施例一本申請的蠶豆葉片蛋白質組學分析的樣品制備方法
[0042] 本申請公開的蠶豆葉片蛋白質組學分析的樣品制備方法，包括W下步驟:稱取蠶 豆幼苗葉片^液氮研磨^提取緩沖液^離屯、棄上清^丙酬沉淀^真空干燥沉淀^加入裂 解液^離屯、取上清^蛋白定量^分裝冷凍^樣品水化^樣品制備完成。
[0043] (1)用電子天平準確稱取蠶豆葉片鮮樣2. Og。
[0044] (2)將研鉢提前放置-20°C冰箱預冷，將步驟（1)稱量好的蠶豆葉片鮮樣放置在預 冷的研鉢中用液氮快速冷凍并充分研磨至細粉。
[0045] (3)將步驟(2)研磨好的粉末快速轉移到50ml離屯、管中，加入預冷的25ml提取緩沖 液(10%TCA/丙酬+0.07%β-琉基乙醇），滿旋混勻后放置在-20°C環境下過夜沉淀。
[0046] (4)取出步驟(3)過夜沉淀后的樣品，棄去沉淀，取上清液，按1ml/管分裝成24管， 在4°C、20000 X g下離屯、20min，棄去上清液。
[0047] (5)向步驟(4)得到的沉淀中加入25ml含0.07%β-琉基乙醇的-20°C預冷丙酬，然 后用剪去尖頭的1ml槍頭將沉淀輕輕搗碎，使沉淀與丙酬充分接觸后，轉移使其減少至12 管。滿旋混勻后在-20°C條件下靜置20min，靜置結束后在4°C、20000Xg下離屯、20min，棄去 上清液，重復此步驟1次，同時轉移使其減少至6管。
[004引 （6)向步驟（5)得到的6管沉淀中加入40ml含0.07 % β-琉基乙醇的90 %預冷的丙