一種蜱蟲樣品掃描電鏡固定配方及方法
【技術領域】
[0001]本發明屬于寄生蟲掃描電鏡樣品固定方法技術領域，特別是涉及一種蜱蟲樣品掃描電鏡固定配方及方法。
【背景技術】
[0002]蜱也叫壁虱，具有較多地方性俗名，如草癟子、狗豆子、草爬子、草蜱蟲、隱翅蟲等，是一類在哺乳動物、爬行類、鳥類和兩棲類等脊椎動物體表依靠吸食其血液生存的節肢動物。對病原的傳播及危害程度僅次于蚊類，同時也是動物和人類多種疾病的貯藏宿主和傳播媒介。蜱在叮咬人、畜吸血時釋放毒素，可導致癱瘓、刺激癥、毒性反應及宿主的過敏反應。在我國蜱蟲是多種病原的媒介蜱，可引起Q熱、巴貝斯蟲病、泰勒蟲病、森林腦炎、新疆出血及萊姆病等，對我國畜牧業造成了巨大的威脅。通過對蜱蟲的形態學鑒定，有助于從傳播媒介對疾病進行防控，對我國蜱傳疾病綜合防控具有應用意義。蜱蟲形態學鑒定主要通過體視顯微鏡和肉眼觀察，我國境內蜱蟲屬與屬之間很容易區分，但種與種之間由于在生活環境、宿主范圍、季節消長規律和生活史等方面相似，在形態學上不易區分，同時，由于使用的主要儀器，體視顯微鏡觀察范圍有限，不能清晰觀察到蜱蟲更細微的特征結構，無助于形態學鑒定。因此，要獲得更為詳細的蜱蟲結構的特征信息，需要借助掃描電子顯微鏡進行觀察。
[0003]掃描電鏡(SEM)是介于透射電鏡和光學顯微鏡之間的一種微觀性貌觀察手段，可直接利用樣品表面材料的物質性能進行微觀成像。主要是利用二次電子信號成像來觀察樣品的表面形態，即用極狹窄的電子束去掃描樣品，通過電子束與樣品的相互作用產生各種效應。其中，主要是樣品的二次電子發射，可以觀察到比0.2μπι更小的精細結構。通過掃描電鏡觀察生物樣品，可以有效的獲得較光學顯微鏡觀察結果更為細微的結構特征，是生物學研究的重要手段之一。而能否獲得有效的、真實的、客觀的、理想的樣品表面的微小特征，樣品的制備方法是決定性因素。在蜱蟲寄生蟲樣品制備過程中，主要通過清洗、固定、脫水、真空干燥和噴金等環節。干燥是掃描電鏡生物樣品制備中的關鍵環節，如果處理不好，會直接影響到觀察的清晰度與準確度，甚至直接導致試驗失敗。含水量高的樣品在掃描電鏡真空的鏡筒中將造成諸多不良后果。樣品受電子束轟擊后蒸發的水蒸氣遭遇高能電子流，產生電離而放電，引起束流大幅度波動，使圖像模糊，出現霧狀，或者根本不能成像。大多數樣品在高真空中容易發生形態損傷，使研究特征皺縮、變形。蜱蟲寄生蟲體壁具有一定程度的骨化，水分主要分布在內臟器官，使用常規配方戊二醛固定液穿透能力很差，不能對其內部組織器官進行有效的固定。對其進行真空干燥時，隨著水分的蒸發而引起蜱蟲寄生蟲樣品體積變小、結構皺縮、表面干裂等，制備蜱蟲寄生蟲具有一定難度。
【發明內容】
[0004]本發明的目的:提供一種蜱蟲樣品掃描電鏡配方及方法解決常規配方的固定液和方法穿透能力很差問題。
[0005]解決上述技術問題所采用的技術方案如下:一種蜱蟲樣品掃描電鏡固定配方，該固定配方是由PBS緩沖溶液、聚山梨酯及戊二醛制作成戊二醛固定液。
[0006]所述的戊二醛固定液按體積百分比:聚山梨酯0.055-0.065%、規格為50%的戊二醛3-6%及余量的PBS緩沖溶液配比而成。最佳梯度配比1.5%戊二醛固定液100.06mL:由97mL的PBS緩沖溶液和60yL聚山梨酯和3mL50%戊二醛配制而成；或2.5%戊二醛固定液100.06mL:由95mL的PBS緩沖溶液和60yL聚山梨酯和5mL50%戊二醛配制而成；或3.5%%戊二醛固定液100.06mL:由94mL的PBS緩沖溶液和60yL聚山梨酯和6mL50%戊二醛配制而成。
[0007]—種利用權利要求1所述的固定配方固定蜱類樣品的方法，包括步驟(一)觀察蜱蟲樣品假頭基內是否有殘留的宿主組織，若有則去除;該方法還包括下述步驟:
(二)用PBS緩沖液清洗蜱蟲樣品體表，并用超聲波進行清洗；
(三)將蜱蟲樣品浸于PBS緩沖液，用戊二醛固定液在室溫下進行蜱蟲樣品固定；
(四)固定后的蜱蟲樣品，用PBS緩沖液清洗，放入通風櫥自然干燥后，依次進行乙醇的梯度脫水；
(五)將蜱蟲樣品放入無水乙醇與丙酮的混合液中進行置換;最后放入丙酮進行置換；
(六)將蜱蟲樣品放入真空冷凍干燥儀進行干燥，將獲得的蜱蟲樣品進行噴金，即可完成蜱蟲樣品的固定制作。
[0008]所述步驟(二)中PBS緩沖液的pH值為7.2 ；超聲波清洗時間為60min。步驟(三)具體是指:將蜱蟲樣品浸于PBS緩沖液，在解剖鏡下將蜱蟲第1?3基節下方輕刺3個小孔，在室溫下，將處理好的蜱蟲樣品1.5%戊二醛固定液固定3h，后再用2.5%戊二醛固定液固定4h，最后再用3%戊二醛固定液固定5h。步驟(四)中依次進行乙醇的梯度脫水是指依次進行規格為30%的乙醇，50%的乙醇，70%的乙醇，80%的乙醇，90%的乙醇，100%的乙醇和100%的乙醇梯度脫水，每次脫水lOmin。步驟(五)首先將蜱蟲樣品放入無水乙醇與丙酮體積比為1:1的混合液中進行8min的置換;再放入無水乙醇與丙酮體積比為1:4的混合液中進行1 Omin的置換；最后放入100%丙酮進行30min置換。步驟(六)中真空冷凍干燥儀的真空度為0.lmbar，溫度-42°C。步驟(六)中蜱蟲樣品進行噴金的方法為:第一次對蜱蟲樣品進行背面噴金，進行掃描電鏡觀察;然后將蜱蟲樣品取下，進行第二次腹面噴金即可，噴金后樣品再次進行掃描電鏡觀察。上述中PBS緩沖液的pH值都為7.2。
[0009]本發明的有益效果:按照本發明的配方及方法固定的蜱蟲樣品，蜱蟲體表表面干燥完整，并與內容物密切結合，緊密而堅實。在鍍金過程中，用時更少且鍍膜均勻。掃描電鏡觀察時樣品不會因電子束轟擊后產生水蒸氣遭遇高能電子流電離而放電，出現圖像模糊、霧狀，或者根本不能成像的現象。
[0010]下面結合附圖對本發明作進一步的說明，附圖1為不同梯度戊二醛+不同梯度下乙醇脫水+真空冷凍干燥法處理;附圖2為不同梯度下戊二醛濃度+不同梯度下乙醇脫水處理；附圖3為常規配方戊二醛濃度+真空冷凍干燥儀處理;附圖4為常規配方戊二醛濃度+不同梯度下乙醇脫水處理。
【具體實施方式】
[0011]實施例1、12只雄性成蟲蜱蟲檢查其假頭基內是否有殘留的宿主組織，若有用精細的手術鉗去除。用PBS緩沖液(pH=7.2)仔細清洗蜱蟲體表，再用超聲波