一種用于檢測白色念珠菌的噬菌體復合納米線的制作方法
【技術領域】
[0001] 本發明屬于醫學檢驗領域，涉及一種用于檢測白色念珠菌的噬菌體復合納米線， 特別涉及具體為一種利用噬菌體展示及納米技術檢測血清Sap2抗體的噬菌體復合納米線 及應用。
【背景技術】
[0002] 白色念珠菌（Candida albicans)是一種條件致病菌，免疫功能低下的病人容易發 生系統性念珠菌感染（disseminated candidiasis),晚期癌癥病人感染率尤其高。中國天 津醫科大學癌癥研究所的研究表明由于系統性白色念珠菌感染導致的癌癥患者死亡率達 到 15. 46%。因此，白色念珠菌感染已經成為導致癌癥患者死亡的重要原因之一。用于臨床 診斷的血培養缺少靈敏性，病原體檢出需要一定時間，難以早期診斷，延誤治療導致患者死 亡率增高。因此，針對癌癥患者系統性白色念珠菌感染的診斷對于輔助治療和延長病人的 存活時間具有重要的意義。
[0003] 白色念珠菌感染早期分泌天冬氨酸蛋白酶（secreted aspartic proteinases, Sap)，Sap2可作為特異宿主細胞表面蛋白的配體而起作用，能降解多種人體蛋白，引起毛細 血管損傷，去除宿主的防御屏障作用，破壞宿主的補體系統，降解血液中IgA，有助于白色念 珠菌的傳播，還能刺激細胞產生多種細胞因子。而且Sap2是一個重要的血清學標志抗原， 患者血清中抗原出現預示感染已經發展成系統性念珠菌感染，循環的Sap2的濃度與感染 的進展程度呈正相關。
[0004] 目前，血清Sap2抗體的檢測方法主要是ELISA，該方法操耗時長，假陰性高，且包 被所用的重組Sap2蛋白具有制備繁瑣、價格昂貴等缺點。
【發明內容】
[0005] 本發明的一個目的是提供一種用于檢測Sap2抗體的噬菌體復合納米線。
[0006] 本發明所提供的用于檢測Sap2抗體的噬菌體復合納米線，由噬菌體和磁性納米 顆粒組成；所述嗤菌體展示有Sap2蛋白表位多肽和磁性納米顆粒結合多肽，所述Sap2蛋白 表位多肽的氨基酸序列如序列表中序列1所示，所述磁性納米顆粒結合多肽的氨基酸序列 如序列表中序列2所示。
[0007] 在所述噬菌體復合納米線中，每個所述噬菌體的表面結合29-39個（如34個）所 述磁性納米顆粒。
[0008] 在所述噬菌體復合納米線中，所述磁性納米顆粒為納米級Fe304，其粒徑具體可為 10nm 〇
[0009] 所述噬菌體，具體可按照包括如下步驟的方法制備得到：
[0010] (al)將所述Sap2蛋白表位多肽的編碼基因插入到序列5所示的噬菌體載體的兩 個酶切位點Bgl I之間，得到重組載體；將所述磁性納米顆粒結合多肽的編碼基因插入到 所述重組載體的酶切位點Pst I和Hind III之間，得到重組噬菌體載體；
[0011] (a2)將所述重組噬菌體載體轉化大腸桿菌（如大腸桿菌MC1061)，得到重組菌；
[0012] (a3)培養所述重組菌，從而獲得展示有所述Sap2蛋白表位多肽和所述磁性納米 顆粒結合多肽的噬菌體。
[0013] 進一步，所述Sap2蛋白表位多膚的編碼基因具體為序列表中序列3所7K的DNA分 子；所述磁性納米顆粒結合多肽的編碼基因具體為序列表中序列4所示的DNA分子。
[0014] 本發明的另一個目的是提供一種制備所述噬菌體復合納米線的方法。
[0015] 本發明所提供的制備所述噬菌體復合納米線的方法，具體可包括如下步驟：
[0016] (1)按照如上步驟（al)-(a3)，制備得到展示有所述Sap2蛋白表位多肽和所述磁 性納米顆粒結合多肽的噬菌體；
[0017] (2)將所述磁性納米顆粒與所述嗤菌體按照100 μ g :4. 8 X 10npfu比例于 20-25°C (如25°C )共同孵育2· 5-3. 5h (如3h)，得到所述噬菌體復合納米線。
[0018] 其中，將所述磁性納米顆粒與所述噬菌體共同孵育時的液體環境為TBST。所述 TBST的溶劑為水，溶質及濃度如下：Tris-HC120mM，NaC1500mM，Tween-20 0.01 %體積分 數；ρΗ7· 5。
[0019] 所述噬菌體復合納米線在如下（a)-(c)任一中的應用也屬于本發明的保護范圍：
[0020] (a)檢測離體哺乳動物血清中Sap2抗體；
[0021] (b)制備檢測離體哺乳動物血清中Sap2抗體的試劑盒；
[0022] (c)制備檢測哺乳動物是否被白色念珠菌感染的試劑盒。
[0023] 本發明的還一個目的是提供一種用于檢測離體哺乳動物血清中Sap2抗體的試劑 盒。
[0024] 本發明所提供的用于檢測離體哺乳動物血清中Sap2抗體的試劑盒，可含有所述 噬菌體復合納米線、洗滌液、洗脫液、終止液和抗所述哺乳動物IgG酶標二抗。
[0025] 本發明的再一個目的是提供一種用于檢測或輔助檢測哺乳動物是否被白色念珠 菌感染的試劑盒。
[0026] 本發明所提供的用于檢測或輔助檢測哺乳動物是否被白色念珠菌感染的試劑盒， 可含有所述噬菌體復合納米線、洗滌液、洗脫液、終止液和抗所述哺乳動物的IgG酶標二 抗。
[0027] 以上所有的所述洗滌液的溶劑為水，溶質及濃度如下：Tris-HCl 20mM， NaC1500mM，Tween-20 0.01 %體積分數；pH7. 5。所述洗脫液的溶劑為水，溶質及濃度如下： 甘氨酸0. 2M ;pH2. 2。所述終止液的溶劑為水，溶質及濃度如下：Tris-HCllM ;pH9. 1。
[0028] 所述試劑盒中還可含有進行ELISA分析所用的常規試劑。
[0029] 進一步，所述試劑盒中還可含有記載有如下內容的說明書：
[0030] (I)取待測哺乳動物的離體血清或所述血清的稀釋液，將所述噬菌體復合納米 線置于所述血清或所述血清的稀釋液中孵育lh，所述噬菌體復合納米線與所述血清中的 Sap2抗體形成復合物；
[0031] 其中，所述離體血清與所述噬菌體復合納米線的配比可為：血清原液80 μ L :含有 至少6Χ 10、也噬菌體的所述噬菌體復合納米線。在本發明中，具體為血清10倍稀釋液 800 μ L :含有6 X lO'fu噬菌體的所述噬菌體復合納米線。
[0032] (II)利用磁鐵富集所述復合物；
[0033] (III)用所述洗滌液對被富集的所述復合物進行洗滌（如洗滌5次），加入所述洗 脫液靜置l〇min，加入所述終止液，用磁鐵吸附固定所述磁性納米顆粒，所述Sap2抗體存在 于澄清液中；
[0034] 其中，加入所述洗脫液的目的是為了使所述Sap2抗體從所述復合物中脫離出來； 加入所述終止液是因為：所述洗脫液是酸性，加入所述終止液終止反應防止對蛋白破壞。
[0035] (IV)采用抗所述哺乳動物IgG酶標二抗對所述澄清液中的所述Sap2抗體進行 ELISA檢測，測得0D450,記為0D450實驗組；
[0036] 其中，在本發明中，所述"采用抗所述哺乳動物IgG酶標二抗對所述澄清液中的所 述Sap2抗體進行ELISA檢測"具體是按照如下步驟進行的：將所述澄清液包被于ELISA板 上，4°C過夜，37°C 200μ 1 5%脫脂奶粉（即5g脫脂奶粉溶于100ml的PBS中）封閉lh， TBST洗脫5次，抗所述哺乳動物IgG酶標二抗37°C孵育lh ;顯色后2M H2S04終止反應。
[0037] (V)以未感染白色念珠菌的健康所述哺乳動物的離體血清替代所述待測哺乳動物 的離體血清，按照步驟（I)-(IV)進行操作，測得的0D450記為00450_照組；
[0038] (VI)按照如下確定所述待測哺乳動物是否被白色念珠菌感染：若00450^^大 于00450^^^9 2倍，則所述待測哺乳動物被白色念珠菌感染或候選被白色念珠菌感染；若 大于00450$^^^ 2倍，則所述待測哺乳動物體未被白色念珠菌感染或候選未被 白色念珠菌感染。
[0039] 在本發明中，以上所有的所述哺乳動物均具體可為人或兔子，如人；相應的，所述 抗所述哺乳動物IgG酶標二抗具體為抗人IgG酶標二抗，如山羊抗人IgG辣根過氧化酶標 二抗。
[0040] 實驗證明，與現有檢測Sap2抗體的ELISA方法相比，本發明具有以下優點：
[0041] 1.通過嗤菌體肽庫展示技術，首次將展示Sap2蛋白優勢表位和與磁性納米顆粒 結合顆粒的雙展示工程化噬菌體引入到血清檢測中，實現Sap2抗體的快速檢測。
[0042] 2.本發明利用噬菌體復合納米線進行Sap2抗體的快速檢測，能夠大幅度降低血 清Sap2抗體檢測成本。
[0043] 3.該噬菌體復合納米線具有特異性高，檢測過程簡單，結果準確可靠，方便實現 Sap2抗體檢測的臨床推廣應用。
[0044] 總之，本發明成本低廉，操作簡單，檢測過程中無需特殊儀器設備，因此能廣泛應 用于醫院及科學研究，特別適用于農村及基層單位使用。這對白色念珠菌感染的早期發現 具有重要意義。
【附圖說明】
[0045]圖1為利用噬菌體滴度測定法測定多肽與納米材料的親和力結果圖。其中，橫坐 標所示的各磁性納米顆粒結合多肽為表1中編號為1-10的10個多肽，以多肽序列的首尾 氨基酸單字母表示多肽名稱。
[0046] 圖2為SDS-PAGE及Western blot鑒定白色念珠菌Sap2VKYTS表位和與納米材料 結合多肽的雙展示工程化噬菌體的結果。其中，a.為SDS-PAGE結果，1:雙展示工程化噬菌 體，2 :pIII展示VKYTS的噬菌體，3 :野生噬菌體。b.為Western blot驗證雜合噬菌體，1 : Marker ;2 :白色念珠菌感染血清；3 :健康人血清。
[0047] 圖3噬菌體復合納米線制備圖。其中，a.不同滴度雙展示工程化噬菌體與100 μ g 磁性納米材料孵育。b.雙展示工程化噬菌體與磁性納米材料孵育時間圖。
[0048] 圖4噬菌體復合納米線敏感性測定結果。其中，a.噬菌體復合納米線與重組蛋白 對比檢測不同稀釋倍數人血清Sap2抗體的吸光值。b.噬菌體復合納米線檢測Sap2抗體的 靈敏度。b中橫坐標的Anti-Sap2IgG的濃度即為兔源Sap2多克隆抗體稀釋液的濃度。
[0049] 圖5為本發明噬菌體復合納米線穩定性檢測結果。
【具體實施方式】