基于金屬配位的蛋白質分子印跡電化學傳感器的制備方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及蛋白子分子印跡電化學傳感器的制備及應用領域，具體地說是一種基 于金屬配位的蛋白質分子印跡電化學傳感器的制備方法。
【背景技術】
[0002] 分子印跡技術，是指以某一特定的目標分子(模板分子或印跡分子)為模板，制備 對該分子具有特異選擇性聚合物的過程。分子印跡聚合物具有預定性、專一識別性和實用 性，因而被廣泛地應用于分離分析、催化以及傳感器等分析化學領域。分子印跡電化學傳感 器結合電化學傳感器和分子印跡技術，以分子印跡聚合物作為生物識別元件來提高電化學 傳感器的靈敏度和選擇性，目前已被成功用于印跡生物小分子。與此同時，印跡生物大分子 尤其是印跡蛋白質分子，并將其應用于電化學檢測引起了研究者們越來越多的關注。但是 印跡蛋白質分子的電化學傳感器或生物傳感器的靈敏度，由于受到蛋白質分子尺寸大、結 構多變和較低的再鍵合效率等限制，研究進展緩慢。
[0003] 石墨烯由于比表面積大、電催化性能優異及生物相容性好，因而常被用來作為生 物傳感界面來制備性能優良的電化學生物傳感器。
[0004] 金屬配位技術，金屬離子能夠特異性地與蛋白質中的某些基團形成配位鍵，可以 利用蛋白質上的氨基酸殘基與金屬離子的相互作用來固定更多的模板蛋白質，從而在印跡 電極表面產生更多的印跡識別活性位點，提高其靈敏性。
【發明內容】
[0005] 為解決上述存在的技術問題，本發明提供一種基于金屬配位的蛋白質分子印跡電 化學傳感器的制備方法，在石墨稀修飾的玻碳電極上修飾上殼聚糖與金屬銅離子的配合 物，通過電聚合法在修飾電極表面制備分子印跡聚合物膜，從而制備具有特異性選擇識別 能力的分子印跡電化學修飾電極，提高分子印跡電化學傳感器的靈敏度，對模板分子具有 快速、高靈敏性選擇識別能力，可以實現臨床中溶菌酶蛋白Lyz的快速在線分析檢測。
[0006] 為達到上述目的，本發明采用的技術解決方案是： 一種基于金屬配位的蛋白質分子印跡電化學傳感器的制備方法，該蛋白質分子印跡電 化學傳感器由工作電極、參比電極和對電極組成，所述參比電極設置為飽和甘汞電極，所述 對電極設置為鉑絲電極，所述工作電極采用分子印跡電化學修飾電極MIPs-Cu-CS/GR/GCE， 所述MIPs-Cu-CS/GR/GCE通過如下步驟制備： (1)殼聚糖-銅離子配合物修飾電極Cu-CS/GR/GCE的制備： 選取玻碳電極，對其進行表面處理，然后取分散好的石墨烯水溶液滴涂在玻碳電極表 面，置于紅外燈下烘干，制得石墨烯修飾電極GR/GCE;在得到的GR/GCE表面滴涂殼聚糖-銅 離子CS-Cu溶液，晾干后得到Cu-CS/GR/GCE; (2 )印跡聚合物膜修飾電極Ly ziMIPs-Cu-CS/GR/GCE的制備： 將步驟(1)得到的Cu-CS/GR/GCE浸入含有模板蛋白、功能單體和交聯劑的除氧的磷酸 鹽緩沖液中，其中模板蛋白為濃度1 g/L的溶菌酶Lyz，功能單體為濃度0.05~0.12 mol/L的 甲基丙烯酸，交聯劑為濃度0.01~0.2 mol/L的2-乙基-4-甲基咪唑，在-0.2 V ~ 1.2 V電位 范圍內，以100 mV/s的掃速循環伏安掃描5圈后取出晾干，得到LyziMIPs-Cu-CS/GR/GCE; (3 )溶菌酶分子印跡電化學修飾電極MIPs-Cu-CS/GR/GCE的制備： 將步驟(2)得到的LyziMIPs-Cu-CS/GR/GCE浸入一定濃度洗脫液中，采用循環伏安法在 電壓-0.2V~ 1.2V、掃描速率100mV/S進行洗脫，溶菌酶分子Lyz被洗脫出來，得到MIPs-Cu-CS/GR/GCE。
[0007] 步驟（1)中所述石墨烯為石墨烯本體或經功能化的石墨烯，所述石墨烯水溶液的 濃度為 1 mg/mL，取5.0 yL。
[0008] 步驟（1)中所述CS-Cu溶液，是將3 mg/mL殼聚糖乙酸溶液（2%，w/V)中加入0.01 mol/L的CuS04 · 5H20,攪拌均勻使其變成澄清藍色溶液，即為CS-Cu溶液。
[0009] 步驟(3)中所述洗脫液為硫酸溶液，其濃度為1.0 mol/L。
[0010] 本發明還提供了一種由所述方法制備的基于金屬配位的蛋白質分子印跡電化學 傳感器的分子印跡電化學修飾電極MIPs-Cu-CS/GR/GCE。
[0011] 本發明還提供了 一種上述分子印跡電化學修飾電極MIPs-Cu-CS/GR/GCE在檢測 Lyz的應用，將MIPs-Cu-CS/GR/GCE浸入含有Lyz的血漿中培育60 min進行再鍵合，然后將鍵 合后的印跡電極在探針溶液中采用DPV法測其峰電流，根據探針峰電流的變化值與所得到 的印跡電極對不同濃度的模板分子Lyz的電化學響應的線性方程ΔΙ (μΑ) = 38.87 + 3.42 log ayz(g/L)比對，從而得到待測樣品中Lyz的含量，其中電化學探針為[Fe(CN)6 ]3_/4_，濃度為 1 mmol/L。
[0012] 本發明制備的分子印跡電化學傳感器，利用石墨烯優異的導電性來提高基底電極 的靈敏度，利用金屬配位技術，通過殼聚糖、銅離子、模板蛋白質分子間的相互作用，有效增 加了印跡聚合物膜與模板蛋白質分子特異性結合的識別位點，從而提高了印跡電極的靈敏 度和對模板蛋白質分子的選擇性，且能夠縮短再鍵合時間，對模板蛋白質分子具有快速、高 靈敏性選擇識別能力，應用其可以實現臨床中溶菌酶蛋白Lyz的快速在線分析檢測，該制備 過程操作簡單，條件溫和，適合推廣應用。
[0013]【附圖說明】： 圖1為不同印跡電極在含有1 _〇 1 /L的[Fe (CN) 6 ]3V4^的磷酸鹽緩沖液 中的差分脈沖伏安圖（pH 7.0)，掃速為100 mV/s，a為MIPs-Cu-CS/GR/GCE，b為MIPs/ GR/GCE〇
[0014]圖2為不同印跡電極在含有1 mmol/L的[Fe(CN)6]3V4-的磷酸鹽緩沖液中的電化學 阻抗圖（pH 7.0)，頻率為0.01 - 105 Hz，a為 MIPs-Cu-CS/GR/GCE, b為 MIPs-Cu-CS/GR/ GCE再鍵合Lyz后，c為 LyziMIPs-Cu-CS/GR/GCE。
[0015] 圖 3為[Fe(CN)6]3-/4-在 MIPs-Cu-CS/GR/GCE(a)和 MIPs/GR/GCE(b)上的峰電流隨著 再鍵合時間的變化情況。
[0016] 圖4為MIPs-Cu-CS/GR/GCE對1.0 X 10-6 g/L的Lyz，BSA，BHb和Cyt-C的選擇性。 [00Π ] 圖5為[Fe(CN)6]3-/4-在MIPs-Cu-CS/GR/GCE上的響應電流變化值與Lyz濃度的關 系。
[0018]【具體實施方式】： 下面結合附圖和具體實施例對本發明進行詳細描述： 本發明闡述了一種基于金屬配位的蛋白質分子印跡電化學傳感器的制備方法，該蛋白 質分子印跡電化學傳感器由工作電極、參比電極和對電極組成，所述參比電極設置為飽和 甘汞電極，所述對電極設置為鉑絲電極，所述工作電極采用分子印跡電化學修飾電極MIPs-Cu-CS/GR/GCE，所述 MIPs-Cu-CS/GR/GCE 通過如下步驟制備： (1) Cu-CS/GR/GCE的制備 選取玻碳電極，先將玻碳電極在金相砂紙上打磨，然后在麂皮上依次用〇.3 μπι和0.05 μπι Α12〇3粉拋光成鏡面，再用二次蒸餾水沖洗玻碳電極表面，并分別置于二次蒸餾水和乙醇 中超聲洗滌20s，室溫下晾干;取5.0 uL分散好的1 mg/mL石墨烯水溶液滴涂在玻碳電極表 面，置于紅外燈下烘干，制得GR/GCE;在得到的GR/GCE表面滴涂5.0 uL分散好的CS-Cu溶液， 晾干后得到Cu-CS/GR/GCE; (2) LyziMIPs-Cu-CS/GR/GCE 的制備 將步驟(1)得到的Cu-CS/GR/GCE浸入含有模板蛋白、功能單體和交聯劑的除氧的磷酸 鹽緩沖液中，其中模板蛋白為濃度1 g/L的溶菌酶Lyz，功能單體為濃度0.05~0.12 mol/L的 甲基丙烯酸，交聯劑為濃度0.01~0.2 mol/L的2-乙基-4-甲基咪唑，在-0.2 V ~ 1.2 V電位 范圍內，以100 mV/s的掃速循環伏安掃描5圈后取出晾干，得到LyziMIPs-Cu-CS/GR/GCE; (3) MIPs-Cu-CS/GR/GCE 的制備 將步驟(2)得到的LyziMIPs-Cu-CS/GR/GCE浸入1.0 mol/L的H2S〇4洗脫液中，采用循環 伏安法在電壓-〇. 2V~ 1.2V、掃描速率100mV/S進行洗脫，溶菌酶分子Lyz被洗脫出來，得到 MIPs-Cu-CS/GR/GCE，SP 為工作電極。
[0019] ⑷分子印跡電化學傳感器的制備 將步驟(3)得到的MIPs-Cu-CS/GR/GCE作為工作電極，和參比電極、對電極正確連接在 電化學工作站上以組成分子印跡電化學傳感器，所述參比電極為飽和氯化鉀甘汞電極，對 電極為鉑絲電極。
[0020]作為優選的方式，步驟(1)中所述石墨稀為石墨稀本體或經功能化的石墨稀，所述 石墨稀水溶液的濃度為1 mg/mL，取5.0 yL。
[0021 ]作為優選的方式，步驟（1)中所述CS-Cu溶液，是將3 mg/mL殼聚