一種測量葉片內部離子濃度時探頭穿刺位置的確定方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及一種植物生理檢測方法，具體涉及一種基于掃描電子顯微（SEM)技術 和X射線能譜(EDX)技術相結合的方式來確定葉片內部離子濃度測量探頭穿刺位置的一種 方法，屬于檢測技術領域。
【背景技術】
[0002] 作物營養精確、快速檢測技術是精確農業發展的基礎，微觀尺度的檢測因其早期 性和精確性受到廣大研究人員的關注。
[0003] 從植物生理上看，營養脅迫使得植物體液濃度、理化性質以及葉水勢等都會發生 一系列的變化，這些變化會導致作物葉片內離子濃度的變化，因此，可以通過檢測葉片內的 離子濃度變化實現植物營養狀態的診斷。
[0004] 現有微觀尺度營養檢測最常用的是離子選擇性微電極。
[0005] 用微電極來測作物營養狀態的方法，都是通過將探頭插入作物葉片，通過測量葉 肉組織內部離子濃度差異實現營養狀態的測量。因為葉片內部細胞的排列分布在葉片厚度 方向存在差異，因此探頭的插入位置和插入深度直接決定著測量結果。
[0006] 番茄葉片表面廣泛分布著絨毛、維管束等結構，葉片的厚度一般在100um左右，葉 肉組織在厚度方向上由上表皮、柵欄組織、海綿組織和下表皮組成。現有測量方法，微電極 的插入基本采用經驗法，因穿刺位置和深度為隨機選擇，直接影響測試結果，導致測量不準 確。
[0007] 本發明從微觀尺度出發，分析葉片的結構組成、各元素在葉片厚度方向的分布特 征，結合微電極的形狀參數，確定了最佳穿刺位置和最佳穿刺深度。
【發明內容】
[0008] 本發明目的在于提供一種測量葉片內部離子濃度時探頭穿刺位置的確定方法，以 提高測量的準確度
[0009] 為了解決以上技術問題，本發明針對目前探頭刺入位置和刺入深度的隨機性問 題，利用掃面電子顯微技術和能譜技術相結合的方法，通過對葉片微結構和葉片組成各元 素在葉片內分布情況的統計分析，基于葉片微結構和能譜分析，以確定葉片內部離子濃度 測量時探頭的最佳穿刺位置和穿刺深度，具體技術方案如下：
[0010] -種測量葉片內部離子濃度時探頭穿刺位置的確定方法，其特征在于包括以下步 驟：
[0011] 步驟一:避開主脈切取葉片得葉片樣品，葉片樣品大小為2cm*2cm，并用固定液對 所取葉片樣品進行固定；
[0012] 步驟二:制備掃描電鏡樣品，并設置儀器參數并觀察；
[0013] 步驟三:觀察分析葉片樣品表面結構；
[0014] 步驟四：確定探頭最佳穿刺位置；
[0015] 步驟五:觀察葉片樣品的斷面結構；
[0016] 步驟六:獲取鎂、鉀和鈣元素在葉片樣品組織中的縱向分布狀況；
[0017] 步驟七:確定最佳的穿刺位置和穿刺深度。
[0018] 所述步驟一中固定液為濃度為4%的戊二醛固定液對所取葉片樣品進行固定。
[0019] 步驟二具體為：將步驟一所得的葉片樣品經乙醇階梯脫水后，放入由英國Quorum 公司生產的K850型臨界點干燥儀中進行干燥處理，將制備好的葉片樣品粘在導電膠上，放 入由日本SHINKKU VD公司生產的MSP-1S型離子濺射儀中進行鍍膜，濺射金屬厚度為20nm， 然后將處理好的葉片樣品粘貼在由美國fei公司生產的quanta200型掃描電鏡的樣品臺上， 在15kV加速電壓下進行觀察，拍照。
[0020] 所述步驟三具體為:在掃描電子顯微系統下，選擇不同區域10個視野觀察葉片樣 品表面微結構，包括絨毛、維管束、氣孔、和表皮細胞的分布密度和幾何尺寸，進行測量和統 計分析，得出葉片樣品表面絨毛、維管束、氣孔、表皮細胞的分布密度和幾何尺寸。
[0021] 所述步驟四具體為:根據步驟三中觀察得的葉片樣品表面微結構，根據絨毛密度 和維管束的分布特征，結合探頭幾何尺寸和材料參數特征，選擇葉片背面避開維管束的位 置作為探頭穿刺位置。
[0022] 所述步驟五具體為:在掃描電鏡下觀察葉片樣品斷面層，測量表皮、柵欄組織、海 綿組織和整個葉片厚度;選取典型視野進行拍照;每個葉片樣品電鏡觀察統計至少10個視 野，取平均值。
[0023] 所述步驟六具體為:借助能譜測量系統，在葉片樣品斷面層內，分別對柵欄組織和 海綿組織進行全譜智能面掃描后得到鎂、鉀和鈣元素在葉片樣品組織中的縱向分布狀況。
[0024] 所述步驟七具體為:根據葉片樣品正反表面絨毛、維管束、氣孔的幾何尺寸和分布 密度，確定探頭從葉片反面穿刺進入葉片的位置;根據葉片樣品中鎂、鉀和鈣元素在葉片樣 品組織中的縱向分布位置確定測量Mg2+，K+，和Ca2+離子濃度時對應的探頭穿刺深度。
[0025] 本發明具有如下優點：本發明從微觀尺度觀察分析葉片的結構特征，通過對葉片 微結構參數的分析確定了探頭在葉片表面的最佳穿刺位置，通過對葉片斷面組織能譜的分 析得到葉片內鎂、鉀、鈣元素的分布特征，通過對葉片內部鎂、鉀、鈣元素分布特征的分析， 確定了探頭的最佳穿刺深度，從而提高了測量的準確度。
【附圖說明】
[0026] 下面結合附圖和具體實施方法對本發明做出進一步詳細的說明。
[0027]圖l_a是本發明葉片正面微結構示意圖；
[0028] 圖l_b是本發明葉片反面微結構示意圖；
[0029] 圖2-a是本發明是探頭結構圖；
[0030] 圖2-b是本發明葉片表面微結構圖；
[0031] 圖3-a是本發明柵欄組織能譜面掃描區域；
[0032] 圖3-b是本發明柵欄組織面掃描區域各元素對應的能譜；
[0033] 圖4-a是本發明柵欄組織能譜面掃描區域；
[0034] 圖4-b是本發明葉片海綿組織內的元素分布。
【具體實施方式】
[0035]下面以番茄為例，結合附圖對本發明進行進一步詳細描述。
[0036]本發明【具體實施方式】中所米用的掃描電子顯微鏡（SEM)是由美國fei公司生產的 quanta200型，能譜分析系統(EDS)是由英國牛津公司生產的Inca X-Act型電制冷能譜儀。 利用該掃描電子顯微系統和能譜分析系統采集并分析溫室番茄葉片微結構和內部的各元 素的分布情況，并依此為依據。本發明于2015年3月至2015年8月在江蘇大學現代農業裝備 與技術教育部重點實驗室玻璃溫室中進行實驗，番茄品種選用粉霞。本發明采用無土栽培 方式進行樣本培育，采用山崎培養營養液進行澆灌。為了保證樣本的代表性，對每個植株的 倒七葉進行取樣，測量在南京林業大學顯微中心完成。
[0037] (1)樣本活體結構固定
[0038]為保證葉片在取樣后觀察時保持生長時的表面微結構狀態，在溫室取樣后立刻投 入事先配好的4%的戊二醛固定液中。
[0039] (2)掃描電鏡樣品制備與觀察
[0040 ]固定后樣品經乙醇階梯脫水后，放入由英國Quorum公司生產的K8 50型臨界點干燥 儀中進行干燥處理，將制備好的樣品粘在導電膠上，放入由日本SHINKKU VD公司生產的 MSP-1S型離子濺射儀中進行鍍膜，濺射金屬厚度為20nm，然后將其粘貼在掃描電鏡樣品臺