一種測定三尖杉科植物中三尖杉生物堿總堿含量的方法
【技術領域】
[0001]本發明屬于生物堿總堿含量測試技術領域，具體涉及一種測定三尖杉科植物中三 尖杉生物堿總堿含量的方法。
【背景技術】
[0002] 三尖杉科(Cephalotaxaceae)僅有三尖杉屬1屬，該屬植物共有7個種2個變種，包 括篦子三尖杉（0.〇1；^61'；〇、日本粗榧（(].1^1'1'；[1^1：011丨3)、寬葉粗榧（(].]^11：丨；1^〇1丨3)、粗榧 ((].8；[11611818)、海南粗榧（0.1]1&1111；[；0、三尖杉（0.；1^01'1：11116；0、高山三尖杉（0.；1^01'1：111161 var .alpine)、臺灣粗榧（C. sinensis var.wilsoniana)、貢山三尖杉（C. lanceolata)。本科 分布于東亞南部及中南半島，主產中國。零星分布于橫斷山脈以東、秦嶺至大別山與江蘇南 部以南的省區及臺灣。
[0003] 該科植物均含有次生代謝產物三尖杉生物堿，為該科植物特有的次生代謝產物。 于1954年首次發現，目前已鑒定出的三尖杉生物堿有50多種。其中部分化合物已被鑒定具 有藥物活性而備受關注，例如：三尖杉酯堿（h a r r i n g t ο n i n e )、高三尖杉酯堿 (homoharringtonine)、脫氧三尖杉酯喊（deoxyharringtonine)和異三尖杉酯喊 (isoharringtonine)。這些化合物在治療白血病、淋巴癌、皮膚癌、鼻咽癌等疾病方面有效。
[0004] 不同種的三尖杉科植物含有的三尖杉生物堿不同，不同的部位也有明顯差異。并 且隨著產地、植株年齡及逆境的變化而變化。盡管可以通過液質聯用、核磁共振的方法逐個 定量、定性分析這些單體化合物。但是，目前仍然缺少安全、快捷、準確的三尖杉生物堿總堿 的測定方法。
[0005] 因此，建立三尖杉科植物中三尖杉生物堿總堿測定方法對于快速評估收獲時期和 藥物提取等方面有重要意義。
【發明內容】
[0006] 本發明的所要解決的技術問題是提供一種測定三尖杉科植物中三尖杉生物堿總 堿含量的方法，該方法簡便、安全、快捷、準確。
[0007] 本發明利用三尖杉生物堿的母環結構具有亞甲二氧基，亞甲二氧基在酸性條件下 可以水解生成甲醛，而甲醛和變色酸進一步反應可以顯色，根據朗博-比爾(Lambert-Beer) 定律可以測定總堿含量。
[0008] 本發明上述所要解決的技術問題是通過如下技術方案來實現的：一種測定三尖杉 科植物中三尖杉生物堿總堿含量的方法，包括以下步驟：
[0009] (1)選取三尖杉堿標準品，采用有機溶劑配制一組具有濃度梯度的三尖杉堿標準 溶液，將該組具有濃度梯度的三尖杉堿標準溶液揮干有機溶劑，然后加入變色酸溶液、濃磷 酸和過氧化氫，搖勻后微波加熱，得標準品反應液；
[0010] (2)將標準品反應液冷卻至室溫，加入蒸餾水定容，并比色，將比色得到的吸光值 與步驟（1)中的三尖杉堿標準溶液的濃度相關聯，建立三尖杉堿吸光度值-濃度的標準曲 線；
[0011] (3)選取三尖杉科植物樣品，烘干后粉碎，獲得生藥粉末，取生藥粉末，加入氨水， 混勻后再加入氯仿浸提，浸提結束后過濾、離心，取氯仿層，揮發掉氯仿，殘留物用有機溶劑 定容；
[0012] 或選取三尖杉科植物的懸浮培養細胞，離心后，取沉淀物，加入氨水，混勻后再加 入氯仿，攪拌后超聲處理，浸泡過夜浸提，浸提結束后過濾，取濾液，并揮發掉氯仿，殘留物 用有機溶劑定容；
[0013] (4)取定容后樣品，加入變色酸溶液、濃磷酸和過氧化氫，搖勻后微波加熱，冷卻至 室溫，加入蒸餾水定容，并比色，將測得的吸光值代入步驟(2)建立的三尖杉堿吸光度值-濃 度的標準曲線，獲得三尖杉科植物樣品的濃度，經換算即獲得三尖杉科植物樣品中三尖杉 生物堿總堿含量。
[0014] 在上述測定三尖杉科植物中三尖杉生物堿總堿含量的方法中：
[0015] 步驟（1)中所述的一組具有濃度梯度的三尖杉堿標準溶液的濃度分別優選為0、 250、500、1000、2000yg/mL。
[0016] 步驟(1)和步驟(3)中所述的有機溶劑優選為甲醇。
[0017] 步驟（1)中所述變色酸溶液、濃磷酸和過氧化氫與每個三尖杉堿標準溶液的用量 關系優選為：200~400yL:2~4mL、50~100yL:50~150yL，其中變色酸溶液的濃度優選為 0.1~0.2g/mL，濃磷酸的質量百分含量優選為80~85%，過氧化氫的濃度優選為0.020~ 0·025mol/L。
[0018] 步驟（1)中變色酸溶液、濃磷酸和過氧化氫與每個三尖杉堿標準溶液的用量關系 最佳為：300yL: 3mL、70yL: 100yL，其中變色酸溶液的濃度最佳為0. lg/mL，濃磷酸的質量百 分含量最佳為85%，過氧化氫的濃度最佳為0.025mol/L。
[0019] 步驟(1)和步驟(4)中在三尖杉生物堿總堿中加入變色酸溶液、濃磷酸和過氧化氫 時，反應充分，加熱時間短。
[0020] 使用濃磷酸和過氧化氫作為反應介質，三尖杉生物堿總堿中的亞甲二氧基水解為 甲醛，甲醛和變色酸反應生成紫色絡合物在該介質條件下可以一步完成，并且使用濃磷酸 較濃硫酸安全性得以提高。
[0021 ]步驟(1)和步驟(4)中微波加熱時，微波功率優選為1000~1200W，加熱時間優選為 30~38s〇
[0022] 步驟(2)和步驟(4)中比色時，優選于波長540~580nm處比色。
[0023] 步驟(2)和步驟(4)中比色時，最佳于波長558nm處比色。
[0024]在波長為558nm處比色，具有響應值高的特點，可以提高檢測的靈敏度。
[0025]步驟（3)中所述生藥粉末與氨水和氯仿的用量關系優選為2~5g: 2~5mL: 25~ 40mL，步驟(3)中沉淀物與氨水和氯仿的用量關系為3~5g:0.5~1.5mL:10~20mL，其中氨 水的質量百分含量為20~28%。
[0026]步驟(3)中所述生藥粉末與氨水和氯仿的用量關系最佳為：38:21111^3〇1111^，其中氨 水的質量百分含量為28% ;步驟(3)中沉淀物與氨水和氯仿的用量關系為4g:lmL:15mL。
[0027]步驟(3)中選取三尖杉科植物樣品，烘干后粉碎時，將三尖杉科植物樣品優選于 105°C烘干30~45min后，再于80~85°C繼續烘干至衡重，烘干的樣品優選粉碎至顆粒小于 420μπι，獲得生藥藥粉。
[0028]步驟(3)中三尖杉科植物樣品優選為三尖杉科植物葉片、枝條或者殺青后的樹皮； 三尖杉科植物優選為海南粗榧。
[0029]步驟(3)中超聲時，超聲波的頻率優選為80Hz，超聲時間優選為30min。
[0030] 步驟(3)中浸提結束后過濾、離心時，離心機轉速為3000~5000r/min，離心時間為 10~20min〇
[0031] 步驟(4)中所述變色酸溶液、濃磷酸和過氧化氫與定容后樣品的用量關系優選為： 200~400yL: 2~4mL、50~1 OOyL: 50~150yL，其中變色酸溶液的濃度優選為0.1~0.2g/mL， 濃磷酸的質量百分含量優選為80~85%，過氧化氫的濃度優選為0.020~0.025mol/L。
[0032] 步驟(4)中所述變色酸溶液、濃磷酸和過氧化氫與定容后樣品的用量關系最佳為： 300yL: 3mL、70yL: 100yL，其中變色酸溶液的濃度為0 . lg/mL，濃磷酸的質量百分含量為 85%，過氧化氫的濃度為0.025mol/L。
[0033] 與現有技術相比，本發明具有如下優點：
[0034] (1)本方法選擇磷酸與過氧化氫作為反應介質，避免了濃硫酸的使用，可以提高試 驗的安全性，且結果更加準確；
[0035] (2)本方法采用微波加熱的方法可以促進反應的進行，縮短反應時間，使實驗更為 快捷；
[0036] (3)本方法采用溶劑揮干的方法，可以排除不同提取方法使用溶劑不同，因背景誤 差而導致測定結果不一致的問題；
[0037] (4)本方法確定了該反應體系條件下，響應值最高的檢測波長，檢測靈敏度高。
【附圖說明】
[0038] 圖1是實施例1中建立的吸光度值-濃度的標準曲線。
【具體實施方式】 [0039] 實施例1
[0040] 本發明方法精密度、穩定性、準確度和回收率情況
[0041] ( - )穩定性測試
[0042] (1)分別取海南粗榧葉片和嫩枝，在105°C烘干30min，然后再在80°C烘干12小時， 粉碎樣品后，用40目篩子過濾，獲得干粉。
[0043] (2)分別稱取葉片和嫩枝干粉3g，加氨水(28% )2mL，加氯仿30mL后，震蕩攪拌器攪 拌均勾，浸泡過夜，離心15min(3000r/min)，取氯仿層溶液10mL，通風櫥內揮發干氯仿，殘渣 用甲醇溶解，轉移至lmL容量瓶中定容，設3次重復。
[0044] (3)分別取海南粗榧葉片和嫩枝樣液50yL和三尖杉堿標準品溶液100yL (2mg/mL， 采用甲醇配制，購自上海源葉生物科技有限公司，下同），放入50mL的燒杯中，揮發干甲醇， 加新鮮配制的變色酸溶液3 0 0 μ L (0 . 1 g / m L，過濾），加入濃磷酸3 m L、過氧化氫7 0 μ L (0.025mol/L)，搖勾，于微波爐中加熱（1200w)35s，取出后室溫下冷卻，加蒸餾水3mL，搖勾， 冷卻至室溫后，加水定容至10mL。
[0045] (3)分別在卟、211、411、611、811、1211、2411于波長558腦比色測定，測定的吸光值如表1 所示，分別計算其平均值和相對標準偏差(RSD)。結果表明標準品和樣品反應后溶液24h內 檢測結果的RSD均在5%以下，三尖杉堿標準品及樣品變色反應后溶液24h內顯色很穩定。 [0046]表1樣品及標準樣品反應后溶液穩定性檢測結果
[0047]
[0048](二)精密度測試
[0049] 取三尖杉堿標準溶液(2mg/mL，采用甲醇配制）100yL，放入50mL的燒杯中，揮發干 甲醇，加新鮮配制的變色酸溶液3 0 0 μ L (0.1 g / m L，過濾），加入濃磷酸3 m L、過氧化氫7 0 μ L (0.025mol/L)，搖勻，于微波爐中加熱（1200w)35s，取出后室溫下冷卻后，加水定容至10mL。 重復6次。計算平均吸光值，相對標準偏差。
[0050] 檢測結果為：平均吸光值為0.4307，相對標準偏差(RSD)為0.59%，表明實驗儀器 精密度良好。
[0051] (三)重復性測試
[0052] (1)分別取海南粗榧葉片和嫩枝，在105°C烘干30min，然后再