抗-mif的免疫組織化學的制作方法
【技術領域】
[0001] 本發明設及巨隧細胞移動抑制因子(MIF)的特異性檢測，特別是組織中的氧化型 巨隧細胞移動抑制因子(oxMIF)。本發明提供一種使用免疫組織化學的檢測方法，其特征在 于使用了特異性的抗-oxMI巧亢體。
【背景技術】
[0002] 巨隧細胞移動抑制因子(MIF)最初是基于其能夠抑制對結核菌素非常敏感的豚鼠 (含巨隧細胞）的腹膜滲出細胞在體外隨機移動的能力而被分離的細胞因子（Bloom等， Science .，153，80-2( 1966)，David等，PNAS .，56，72-7( 1966))。今天，MIF被認為是天生的和 獲得性免疫應答反應的關鍵的上游調節因子，其可施加一系列多效性的活動。
[0003] 人類MIF的cDNA已于 1989年被克隆（Weiser等，PNAS. ,86,7522-6(1989))，其基因 組被定位于22號染色體上。人類MIF基因的產物是一個含114個氨基酸（切除N端甲硫氨酸 后）、約12.5kDa表觀分子量的蛋白質。MIF與其他任何蛋白沒有顯著的序列同源性。該蛋白 質結晶成相同亞基的Ξ聚體。每個單體包含兩個反向平行的α螺旋，α螺旋堆集成有四條鏈 的0折疊。該單體有另外兩個0鏈，它們與相鄰亞基的0折疊相互作用形成單體之間的交界 面。Ξ個亞基排列形成桶，該桶含有溶劑可到達的通道，該通道沿著分子的Ξ折疊軸穿過蛋 白質的中屯、（Sun等，PNAS. ,93,5191-5196(1996))。
[0004] 據報道低濃度的糖皮質激素可m秀導巨隧細胞分泌MIF(Calan化a等，Nature.， 377,68-71 (1995))。然而，MIF也可W反向調節糖皮質激素的效果并且刺激其他細胞因子如 腫瘤壞死因子TNF-a和白介素 IL-Ιβ等的分泌（Baugh等，Crit Care Med，30，S27-35 (2002))"MIF也被證明有如促血管生成，促增生和抗細胞調亡的特性，因此可促進腫瘤細胞 生長（Mitchell，R.A，Cellular Si 即ailing. ,16(1) :p. 13-19(2004) ;Lue，H.等， 化cogene.，26 (35): p. 5046-59 (2007))。其也與如淋己瘤，黑素瘤和結腸瘤的生長直接相關 (Nishihira等，J Interferon Cytokine Res.,20:751-62(2000))。
[0005] MIF是許多疾病狀態的中介因子，因此其與多種疾病相關聯，包括但不限于炎癥性 腸病（I抓），類風濕性關節炎(RA)，急性呼吸窘迫綜合癥(ARDS)，哮喘，腎小球腎炎，IgA型腎 病，屯、肌梗死(MI )，脈毒病和癌癥。對抗重組人類MIF的多克隆和單克隆抗MI巧亢體已被研發 (Shimizu等，FEBS Lett.,381,199-202(1996);Kawaguchi等，Leukoc.Biol.,39,223-232 (1986);Weiser等，Cell.Immunol.,90,167-78(1958)).
[0006] 有人建議抗MIF抗體用于治療。Calan化a等(J. Inflamm.，47，39-51 (1995))曾報道 使用抗MIF抗體可W保護動物免于實驗誘導的革蘭氏陰性和革蘭氏陽性的脈毒性休克。抗 MIF抗體也被建議用作一種治療手段用W調節脈毒性休克和其他炎性疾病狀態下細胞因子 的產生。
[0007] US 6645493中公開了來源于雜交瘤細胞的單克隆抗MIF抗體，其抵消了MIF的生物 活性。在動物模型中顯示出運些鼠源的抗MIF抗體在處理內毒素引發的休克的治療上取得 了有益的效果。
[000引 US 200310235584中公開了在動物體內制備MIF高親和力抗體的方法，該方法中 MIF基因被純合性地敲除。
[0009] Galat等人描述了糖基化抑制因子（GIF)蛋白化ur. J.Biochem.，224,417-21 (1994)) eMIF和GIF現在被認為是相似的。Wa化rai等（PNAS.，97，13251-6( 1997))描述了與 不同的GIF表位相結合的多克隆抗體W便確定Ts細胞中GIF經翻譯后修飾的生物化學本質。 Wa化rai等先前曾報道在體外GIF出現的不同構象同工型。一種異構體是由對單個半脫氨酸 殘基進行化學修飾而產生的。該化學修飾導致了 GIF蛋白質的構象改變。
[0010] MIF的水平，即在各種疾病攻擊之后，尤其是在炎癥性疾病和癌癥攻擊之后檢測到 MIF通常水平會提高。然而，MIF也在健康的個體內循環，其產生了一個明顯的區別困難。相 反地，oxMIF不存在于健康對象體內。oxMIF在疾病狀態下會增加并且可從病患的采樣，如血 液，血清和尿樣中被檢測到。
[0011] 在對MIF和其抗體的徹底研究之后發現，抗體RAB9、RAB4和RAB0特異性地與oxMIF 結合(不能與redMIF結合）。
[0012] 在發明人早期進行的實驗中，證明氧化性的操作步驟如脫氨酸介導氧化，GSSG(氧 化型谷脫甘膚)介導氧化或和Proclin300進行的MIF培養，或蛋白質交聯劑(例如BM0E)均會 引發MIF與上述抗體的結合。
[0013] 該發明人推出的令人驚奇的結論是：
[0014] ?重組的MIF(人源、曬齒類源、鼠源、C冊細胞源、猴源）的氧化還原調節(脫氨酸/ GSSG介導輕度氧化)或利用Proclin300或蛋白交聯劑對重組MIF的處理均會導致其與己克 斯特系抗MIF抗體RAB9，RAB4和RAB0相結合；
[0015] 參oxMIF的減少導致Ab結合的降低；
[0016] ?oxMIF異構體的特異性與體內生物學Ab的功效相關；
[0017] ?oxMIF的水平與疾病狀態相關聯。
[0018] 關于MIF的其他知識作為本發明人進一步研究的基礎。
[0019] 目前，對組織切片中的oxMIF進行檢測和染色方法尚不存在。已經知道MIF存在不 同的異構體。天然存在的oxMIF的被認為是一項對與MIF相關的疾病狀態的有力和可靠的指 標，通過免疫組織化學下稱為IHC)或免疫巧光（IF)方法對其在組織，例如載玻片上的組 織切片的特異性檢測受到下述事實的阻礙：當使用標準IHC或IF方法時，oxMIF的結構易受 影響或頻繁地完全丟失。
[0020] 因此，明確地需要一種oxMIF異構體的可靠的檢測方法。本申請發明人解決了該需 要，而且下文描述的發明實現了該目標。
【發明內容】
[0021] 本發明設及一種用于oxMIF(氧化型巨隧細胞移動抑制因子)檢測的檢測方法。該 檢測方法基于一種免疫組織化學的原理。其在組織樣品，尤其是組織切片中使用。
[0022] 優選地，運些組織切片提供在玻璃或塑料載體上，例如玻璃的或塑料的載物片。
[0023] 該方法使用對oxMIF具有特異性的結合抗體。
[0024] 本發明中使用的優選的抗體為單克隆抗體。在特別優選的實施例中，單克隆抗 oxMIF抗體選自由RAB9、RAB0和/或RAB4構成的組，或者選自由RAM9、RAM0和/或RAM4構成的 組，其在下文中將進行詳細描述。
[0025] 本發明的優勢特異性已通過(參照下文的實施例部分)可利用同型對照抗體(不能 夠檢測oxMIF因此適合作為陰性對照)或多克隆抗MIF抗體(與全部MIF相結合，由refMIF和 oxMIF構成，適合作為陽性對照）的對照染色表明了本發明有利的特異性，并且其已通過本 申請發明人的其他發現(即oxMIF只能在疾病，例如癌癥組織中被檢測到)而證實。
[0026] 該檢測方法的優選實施例中包含染色步驟。該創造性的檢測/染色步驟本身被設 計為用于保存組織切片中的天然oxMIF的結構。目前所知的針對本發明的標準技術手段會 導致MIF向oxMIF的轉變，因此會在免疫組織化學技術中產生假陽性染色。
[0027] 本發明具體內容
[0028] 通過下列諸項描述本發明或其一部分：
[0029] 1.-種用于體外檢測oxMIF的免疫組織化學（IHC)測定方法，其特征在于，所述 oxMIF為個體組織樣品中可與抗體RAB4、RAB9和/或RAB0差異性結合的MIF，其包含用于體外 確定化合物與所述樣品中oxMIF結合的步驟。
[0030] 2.項1所述的IHC測定，其特征在于，與oxMIF結合的所述化合物是與oxMIF特異性 結合的抗體。
[0031 ] 3.項2所述的I肥測定，其特征在于，所述抗體與oxMIF結合，而不與redMIF結合。
[0032] 4.項3所述的IHC測定，其特征在于，所述差別性結合是指與oxMIF結合的其Kd值為 lOOnM W下，優選50nM W下，更優選lOnMW下，而不與redMIF結合的特征在于其Kd值為400nM 社。
[003；3] 5 .項2至4所述的IHC測定，其特征在于所述抗體選自由oxMIF連接物，例如抗體 RAB4、RAB9和/或RAB0和/或RAM4、RAM巧口/或RAM0構成的組。
[0034] 6.上述任一項所述的IHC測定，其特征在于，所述樣品為組織活體，優選冷凍組織 活體，優選0CT包埋切片，或忍針活組織穿刺。
[0035] 7.上述任一項所述的I肥測定，其特征在于，執行下列步驟中的一步或多步：
[0036] a)利用封閉緩沖液進行的可選封閉步驟和
[0037] b)不進行前述步驟，使用第一抗-oxMIF抗體的結合步驟；
[003引 C)可選的固定步驟；
[0039] d)與第二抗體溫育;和/或
[0040] e)染色
[0041 ] 8.前述任一項所述的IHC測定，其特征在于，在結合步驟之前沒有使用有機或無機 固定液，特別是甲醒或丙酬進行固定。
[0042] 9.項7或8所述的IHC測定，其特征在于，在可選的固定步驟之后和/或在第一結合 步驟之前，樣品進行空氣干燥，優選約30分鐘。
[0043] 10.項7-9任一項或多項所述的IHC測定，其特征在于，所述第一抗體是生物素化的 和/或優選地包含在第一稀釋緩沖液和/或其中所述第一抗體與樣品溫育優選進行45-90分 鐘，更優選進行大約60分鐘。
[0044] 11.項7-10任一項或多項所述的IHC測定，其特征在于，在溫育步驟d)之后進行清 洗步驟W洗去多余的抗體。
[0045] 12.項7-11任一項或多項所述的IHC測定，其特征在于，所述第二抗體是結合了辣 根過氧化物酶化RP)的鏈霉親和素。
[0046] 13.項7-12任一項或多項所述的IHC測定，其特征在于，在溫育步驟d)之后進行清 洗步驟。
[0047] 14.項7-13任一項或多項所述的IHC測定，其特征在于，所述染色步驟使用蘇木精 進行。
[0048] 15.上述任一項所述的IHC測定，其特征在于，所述結合步驟使用生物素化的或者 巧光染料標記的結合指示劑進行。
[0049] 16.-種I肥測定盒，適用于執行上述一項或多項所述的方法。
[0050] 上述抗體的不僅可由其自身的基因序列而且通過儲存于大腸桿菌化.coli，TGl菌 株)的質粒中進行表征和支持，上述抗體包含上述抗體RAB0、RAB4和/或RAB9 W及RAM0、RAM4 和RAM9中每一個各自的輕鏈或重鏈。
[0051] 運些質粒的特征在于它們的DSM編號，其為根據布達佩斯條約在德國微生物菌種 保藏中屯、（DSMZKMascheroder Weg化，Braunschweig,Germany)進行保藏而獲得的官方編 號。運些質粒分別保藏在大腸桿菌中。
[0化2] 編號為DSM25110質粒含抗MIF抗體RAB4的輕鏈序列。
[0化3] 編號為DSM25112質粒含抗MIF抗體RAB4的重鏈(IgG4)序列。
[0化4] 在適合的宿主細胞中質粒DSM25110和DSM25112的共表達產生優選的抗MIF抗體 RAB4。
[0055] 編號為DSM25111的質粒含抗MIF抗體RAB9的輕鏈序列。
[0化6] 編號為DSM25113的質粒含抗MIF抗體RAB9的重鏈(IgG4)序列。
[0化7] 在適合的宿主細胞中質粒DSM25111和DSM25113的共表達產生優選的抗MIF抗體 RAB9。
[0化引編號為DSM25114的質粒含抗MIF抗體RAB0的輕鏈序列。
[0化9 ] 編號為DSM25115的質粒含抗MIF抗體RAB0的重鏈(I gG4)序列。
[0060] 在適合的宿主細胞中質粒DSM25114和DSM25115的共表達產生優選的抗MIF抗體 RABOo
[0061 ] 同樣被保藏的有抗體RAM0、RAM9和RAM4;均已根據布達佩斯條約在DSMZ保藏(2012 年4月12日于德國布倫瑞克），編號如下：
[0062] RAM9-重鏈：E.coli GA.662-0l.pRAM9hc-DSM 25860。
[0063] RAM4-輕鏈:E.coli GA.906-04.pRAM41c-DSM 25861。
[0064] RAM9-輕鏈：E.coli GA.661-01.pRAM91c-DSM 25859。
[00化]RAM4-重鏈：E.coli GA.657-02.pRAM4hc-DSM 25862。
[0066] RAMO-輕鏈：E.coli GA.906-0l.pRAMOlc-DSM 25863。
[0067]