用于檢測幽門螺桿菌感染的方法

用于檢測幽門螺桿菌感染的方法
【專利說明】用于檢測幽口螺桿菌感染的方法
[0001 ] 本發明設及用于檢測螺桿菌化elicobacter)感染并且更特別地用于檢測幽口螺 桿菌化.pylori)感染的方法，免疫應答作為生物標志物的用途，螺桿菌蛋白質作為生物標 志物的用途，編碼螺桿菌蛋白質的核酸作為生物標志物的用途，W及用于在檢測螺桿菌感 染并且更特別地用于檢測幽口螺桿菌感染之方法中使用的試劑盒。
[0002] 幽口螺桿菌化elicobacter p^ori，H.pylori)，是一種微需氧的革蘭氏陰性螺旋 菌，其定居在約一半世界人口中并且被認為是人特有的胃部病原體(Michetti等，1999)。大 多數感染個體患有無癥狀的慢性胃炎。然而，在一些對象中，感染引起慢性胃炎、消化性潰 瘍形成和萎縮，并且在粘膜相關淋己組織(mucosa-associated lymphoid tissue,MALT)淋 己瘤、胃腺癌和原發性胃非霍奇金氏淋己瘤的形成中發揮著重要作用(Suganuma等，2001)。
[0003] 世界衛生組織將幽口螺桿菌歸類為I類致癌原(Goto等，1999)，并且已在動物模型 中證明了致癌作用的直接證據化onda等，1998; T. Wa化nabe等，1998)。根除幽口螺桿菌可W 預防人類的胃癌化emura等，2001)。在高胃癌風險的群體中考慮了測試&治療策略(Yamaoka 等，1998)。然而，運些方法因缺少有效且可負擔的篩選系統(尤其是對于社會經濟地位較低 的國家)而受到阻礙。在運些國家中，僅血清學測試可應用，其中大多數具有不良的性能或 者沒有經過很好的驗證。對于幽口螺桿菌血清學，已知且描述了數種特異性單一標志物。運 些因素已被應用于多種診斷方法，但是其幾乎所有都具有很大的限制使得其不適用于幽口 螺桿菌診斷。例如，細胞毒素相關蛋白（cytotoxin-associated p;rotein，CagA)是表征非常 良好的幽口螺桿菌蛋白質。其在cag-PAI(細胞毒素相關基因毒力島）上進行編碼并且被描 述為致癌蛋白質(Franco等，2005;Mura1:a-Kamiya等，2007)。運種蛋白質也是高免疫原性抗 原，使得其可成為血清學測試經常采用的標志物。CagA陽性可W被用作幽口螺桿菌毒力的 指示物，原因是感染CagA陽性菌株的個體處于發生胃與十二指腸疾病的較高風險下。然而， 其不適于用作單一標志物，原因是僅幽口螺桿菌菌株的亞組為化gA陽性。而且，CagA陽性不 是活性感染的特點，原因是根除了幽口螺桿菌的患者多年維持著針對化gA的抗體(Fusconi 等，1999)。因此，其在血清學測試中應一直與其他適當的抗原組合W確定陽性。另一種表征 良好的幽口螺桿菌蛋白質是空泡細胞毒素(vacuolating巧totoxin，VacA)。報道稱，其引 起暴露于幽口螺旋桿菌上清液或經純化蛋白質的細胞中的空泡形成（Cover&Blaser， 1992) nvacA基因編碼140W)a的原毒素，其中氨基端信號序列和簇基端片段在分泌期間被蛋 白質水解切割，從而產生了分子質量為88kDa的活性蛋白質，所述活性蛋白質聚集成六聚體 并形成孔（Montecucco&de Be;rnard，2003)。該蛋白質由兩個不同的區域組成。信號序列 (sla、slb、s2)和中間區域(ml、m2)，二者均具有似乎調控細胞毒性活性的高等位基因變化 (Athedon等，1995)。化cA的高多樣性使得該蛋白質不適用于血清學測試。
[0004] 另一種表征很好的幽口螺桿菌蛋白質Gro化屬于分子伴侶家族，其是許多蛋白質 在應力條件下進行適當折疊所需的(Dunn等，1992)。在不同的研究中，表明該蛋白質在不同 的幽口螺桿菌菌株中是高度保守的，并且其血清陽性甚至高于感染患者中對于化gA的血清 陽性(Macchia等，1993 ; Suerbaum等，1994)。另外，在由本發明人進行的研究中，觀察到 Gro化的陽性血清狀態在德國胃癌患者中比在匹配對照中更為常見(數據未公開）。另外，表 明針對GroEL的抗體在幽口螺桿菌感染的疾病相關損失之后持續得更久。因此，Gro化可為 適用于現癥感染或既往感染的標志物，并且可有助于克服由于感染清除而低估幽口螺桿菌 相關胃癌風險的問題(Gao等，2009)。
[0005] 因此，本發明所基于的問題是提供具有高敏感性和/或高特異性的用于檢測幽口 螺桿菌感染的方法。本發明所基于的另一個問題是提供運樣的測定:與現有技術的測定相 比，其產生較少假陽性和較少假陰性結果，特別是在基于群體的方法中。本發明所基于的又 一個問題是提供用于分別用于執行所述方法和所述測定的手段。本發明所基于的再一個問 題是提供用于幽口螺桿菌感染患者的生物標志物，其中特別地，所述生物標志物優選地顯 示出與其他細菌和任何蛋白質、膚或編碼所述蛋白質和膚的核酸分子沒有任何交叉反應 性。
[0006] 本發明所基于的運些和其他問題通過所附獨立權利要求的主題來解決。一些優選 的實施方案可由所附從屬權利要求獲得。
[0007] 本發明所基于的運些和其他問題還通過W下實施方案來解決。
[0008] 實施方案1:用于在對象中檢測螺桿菌感染并且更優選地幽口螺桿菌感染的方法， 其中所述方法包括在來自所述對象的樣品中檢測針對FliD的免疫應答。
[0009] 實施方案2:實施方案1所述的方法，其中如果在來自所述對象的樣品中檢測到針 對F1 iD的免疫應答，則所述對象正患有螺桿菌感染，優選幽口螺桿菌感染，或者所述對象過 去已經經歷過螺桿菌感染，優選幽口螺桿菌感染。
[0010] 實施方案3:實施方案1至2中任一個所述的方法，其中如果在來自所述對象的樣品 中檢測不到針對FliD的免疫應答，則所述對象未患螺桿菌感染，優選幽口螺桿菌感染。
[0011] 實施方案4:實施方案1至2中任一個所述的方法，其中如果在來自對象的樣品中檢 測不到針對FliD的免疫應答，則所述對象過去已經經歷過螺桿菌感染，優選幽口螺桿菌感 染。
[0012] 實施方案5:實施方案1至4中任一個所述的方法，其中所述針對FliD的免疫應答是 針對F1 iD的抗體應答，優選抗F1 iD抗體應答。
[0013] 實施方案6:實施方案5所述的方法，其中所述針對FliD的免疫應答是針對FliD的 抗體應答，并且其中所述針對FliD的抗體應答包含選自包括IgG抗體和IgA抗體之組中的至 少一種抗FliD抗體。
[0014] 實施方案7:實施方案5所述的方法，其中所述針對FliD的免疫應答是抗FliD抗體 應答，并且其中所述抗FliD抗體應答包含選自包括IgG抗體和IgA抗體之組中的至少一種抗 FliD抗體。
[0015] 實施方案8:實施方案1至7中任一個所述的方法，其中所述對象感染有表達FliD的 螺桿菌，優選幽口螺桿菌。
[0016] 實施方案9:實施方案1至8中任一個所述的方法，其中所述對象不同于免疫抑制的 對象，優選地，所述對象不同于進行免疫抑制治療的對象。
[0017] 實施方案10:實施方案1至9中任一個所述的方法，其中所述方法還包括檢測螺桿 菌(優選幽口螺桿菌)的一種或更多種抗原。
[0018] 實施方案11:實施方案10所述的方法，其中螺桿菌(優選幽口螺桿菌）的一種或更 多種抗原選自包括化gA、化cA、Gro化、化0231、扣P 0940和化rA的組。
[0019] 實施方案12:實施方案1至11中任一個所述的方法，其中所述方法包括使所述樣品 與FliD或其片段反應。
[0020] 實施方案13:實施方案13所述的方法，其中所述方法包括使所述樣品與全長FliD 反應。
[0021] 實施方案14:實施方案12至13中任一個所述的方法，其中所述針對FliD的免疫應 答包含能夠與FliD相互作用的體液化合物和能夠與FliD相互作用的細胞化合物中的至少 一種，其中至少一種體液化合物和/或細胞化合物與FliD相互作用，優選地至少一種與FliD 相互作用的體液化合物和/或細胞化合物與FliD形成相互作用產物。
[0022] 實施方案15:實施方案14所述的方法，其中所述針對FliD的免疫應答是針對FliD 的抗體應答并且其中所述針對FliD的抗體應答與FliD形成相互作用產物。
[0023] 實施方案16:實施方案14所述的方法，其中所述針對FliD的免疫應答是抗FliD抗 體應答并且所述抗F1 iD應答與F1 iD形成相互作用產物。
[0024] 實施方案17:實施方案14所述的方法，其中所述針對FliD的免疫應答包含至少一 種抗F1 iD抗體并且所述抗F1 iD抗體與F1 iD形成相互作用產物。
[0025] 實施方案18:實施方案14至17中任一個所述的方法，其中檢測所述相互作用產物。
[0026] 實施方案19:實施方案18所述的方法，其中直接檢測所述相互作用產物。
[0027] 實施方案20:實施方案18所述的方法，其中間接檢測所述相互作用產物。
[00%]實施方案21:實施方案1至20中任一個所述的方法，其中所述檢測通過化ISA或線 免疫測定進行。
[0029] 實施方案22:實施方案1至20中任一個所述的方法，其中所述檢測通過側向流測定 (lateral flow assay)進行。
[0030] 實施方案23:實施方案1至22中任一個所述的方法，其中所述樣品選自包括血清、 血漿和全血的組。
[0031] 實施方案24:實施方案1至23中任一個所述的方法，其中所述對象是人類并且螺桿 菌感染是幽口螺桿菌感染。
[0032] 實施方案25:實施方案24所述的方法，其中與所述樣品反應的FliD是來自幽口螺 桿菌的FliD。
[0033] 實施方案26:實施方案25所述的方法，其中所述FliD包含根據SEQ ID NO: 1的氨基 酸序列。
[0034] 實施方案27:實施方案1至23中任一個所述的方法，其中所述對象是豬并且螺桿菌 感染是豬螺桿菌化elicobacter suis)感染。
[0035] 實施方案28:實施方案27所述的方法，其中與所述樣品反應的F1 iD是來自豬螺桿 菌化.suis)的 FliD。
[0036] 實施方案29:實施方案28所述的方法，其中所述FliD包含根據SEQ ID N0:3的氨基 酸序列。
[0037] 實施方案30:實施方案1至23中任一個所述的方法，其中所述對象是貓并且螺桿菌 感染是貓螺桿菌化elicobacter felis)感染。優選地，貓選自包括家貓、野貓、小型貓科動 物和大型貓科動物的組。
[0038] 實施方案31:實施方案30所述的方法，其中與所述樣品反應的FliD是來自貓螺桿 菌化.felis)的 FliD。
[0039] 實施方案32:實施方案31所述的方法，其中所述FliD包含根據SEQ ID N0:5的氨基 酸序列。
[0040] 實施方案33:實施方案1至32中任一個所述的方法，其中用于在人中檢測螺桿菌感 染(優選幽口螺桿菌感染)之方法的敏感性大于90 %和/或97 %或W下。
[0041] 實施方案34:實施方案1至33中任一個所述的方法，其中用于在人中檢測螺桿菌感 染(優選幽口螺桿菌感染)之方法的特異性大于90 %和/或99 %或W下。
[0042] 實施方案35:對象中針對FliD的免疫應答作為生物標志物的用途。
[0043] 實施方案36:實施方案35所述的用途，其中所述生物標志物是所述對象感染螺桿 菌的生物標志物。
[0044] 實施方案37:實施方案35至36中任一個所述的用途，其中所述生物標志物是所述 對象感染螺桿菌的生物標志物，其中所述對象是人并且螺桿菌是幽口螺桿菌。
[0045] 實施方案38:實施方案35至36中任一個所述的用途，其中所述生物標志物是所述 對象感染螺桿菌的生物標志物，其中所述對象是豬并且螺桿菌是豬螺桿菌。
[0046] 實施方案39:實施方案35至36中任一個所述的用途，其中所述生物標志物是所述 對象感染螺桿菌的生物標志物，其中所述對象是貓并且螺桿菌是貓螺桿菌。
[0047] 實施方案40:根據實施方案35至39中任一個所述的用途，其中所述生物標志物是 預測性生物標志物。
[0048] 實施方案41:根據實施方案35至40中任一個所述的用途，其中所述免疫應答是針 對FliD的抗體應答。
[0049] 實施方案42:根據實施方案35至41中任一個所述的用途，其中所述免疫應答是針 對FliD的抗FliD抗體應答。
[0050] 實施方案43:試劑盒，其包含FliD或其片段和至少一種另外的構成要素。
[0051] 實施方案44:實施方案43所述的試劑盒，其中所述至少一種另外的構成要素選自 包括緩沖劑、固相和說明書散頁（leaflet)的組。
[0052] 實施方案45:實施方案43至44中任一個所述的試劑盒，其中FliD是全長FliD。
[0053] 實施方案46:根據實施方案43至44中任一個所述的試劑盒，其中FliD包含氨基酸 序列并且其中所述氨基酸序列選自包括W下的組:根據SEQ ID NO: 1的氨基酸序列、根據 SEQ ID NO:3的氨基酸序列和根據SEQ ID NO:5的氨基酸序列。
[0054] 實施方案47:根據實施方案43至46中任一個所述的試劑盒，其中所述試劑盒適用 于用來在對象中檢測螺桿菌感染的方法或者在用于在對象中檢測螺桿菌感染的方法中使 用。
[0055] 實施方案48:根據實施方案47所述的試劑盒，其中所述試劑盒適用于實施方案1至 34中任一個所述的方法或者在實施方案1至34中任一個所述的方法中使用。
[0056] 實施方案49:用于在對象中檢測螺桿菌感染并且更優選幽口螺桿菌感染的方法， 其中所述方法包括在來自所述對象的樣品中檢測FliD。
[0057] 實施方案50:實施方案49所述的方法，其中如果在來自所述對象的樣品中檢測到 F1 iD，則所述對象正患有螺桿菌感染，優選幽口螺桿菌感染，或者所述對象過去已經經歷過 螺桿菌感染，優選幽口螺桿菌感染。
[0058] 實施方案51:實施方案49至50中任一個所述的方法，其中如果在來自所述對象的 樣品中檢測不到FliD，則所述對象未患螺桿菌感染，優選幽口螺桿菌感染。
[0059] 實施方案52:實施方案49至51中任一個所述的方法，其中如果在來自所述對象的 樣品中檢測不到FliD，則所述對象過去已經經歷過螺桿菌感染，優選幽口螺桿菌感染。
[0060] 實施方案53:實施方案49至52中任一個所述的方法，其中所述對象感染表達F1 iD 的螺桿菌，優選幽口螺桿菌。
[0061] 實施方案54:實施方案49至53中任一個所述的方法，其中所述方法還包括檢測螺 桿菌(優選幽口螺桿菌)的一種或更多種抗原。
[0062] 實施方案55:實施方案54所述的方法，其中螺桿菌(優選幽口螺桿菌）的一種或更 多種抗原選自包括化gA、化cA、Gro化、化0231、扣P 0940和化rA的組。
[0063] 實施方案56:實施方案49至55中任一個所述的方法，其中FliD是全長FliD或其片 段。
[0064] 實施方案57:實施方案49至56中任一個所述的方法，其中所述方法包括使所述樣 品與相互作用劑反應，其中所述相互作用劑與FliD或其片段相互作用，優選地所述相互作 用劑與FliD或其片段特異性相互作用。
[0065] 實施方案58:實施方案57所述的方法，其中所述相互作用劑與全長FliD或FliD的 片段相互作用。
[0066] 實施方案59:實施方案57至58中任一個所述的方法，其中所述相互作用劑選自包 括抗體、適配體和spiegelmer的組。
[0067] 實施方案60:實施方案59所述的方法，其中所述相互作用劑是抗體，其中所述抗體 是單克隆抗體或多克隆抗體。
[0068] 實施方案61:實施方案56至60中任一個所述的方法，其中所述相互作用劑與所述 對象中存在的F1 iD形成相互作用產物。
[0069] 實施方案62:實施方案61所述的方法，其中檢測所述相互作用產物。
[0070] 實施方案63:實施方案62所述的方法，其中直接檢測所述相互作用產物。
[0071] 實施方案64:實施方案62所述的方法，其中間接檢測所述相互作用產物。
[0072] 實施方案65:實施方案49至64中任一個所述的方法，其中所述檢測通過ELISA或線 免疫測定進行。
[0073] 實施方案66:實施方案49至63中