溶血性鏈球菌診斷免疫層析試劑、試劑盒及檢測方法
【技術領域】
[0001] 本發明設及一種作為檢測試樣液中的被檢測物(抗原等)革蘭氏陽性菌、特別是溶 血性鏈球菌的簡便的體外診斷試劑盒或者便攜式診斷裝置重要性高的免疫層析試劑盒、其 中使用的試劑組合物或檢體處理液及檢測方法。特別設及一種無需每次通過用時制備來制 備溶血性鏈球菌檢測中所需的多糖體的提取所需要的亞硝酸，而是使其在檢測設備上生成 從而提高了檢測效率及檢測精度的檢測方法。
【背景技術】
[0002] 近年來，關于免疫層析用條狀形式的免疫測定，W利用抗體具有的特異性反應性 來檢測試樣液中的被檢測物(抗原等）的簡便的體外診斷試劑盒或者便攜式診斷裝置的形 式使得通用性提高了。特別是最近關于基于免疫層析法的簡便的檢測工具(其用于檢測有 無感染流感病毒或細菌運樣的病原體)也受到關注，已持續進行研究開發。
[0003] 溶血性鏈球菌下也稱為溶血性鏈球菌。）的診斷通過W類屬特異性的多糖體為 抗原進行檢測來進行。作為多糖體的提取法，已知有使用了酶或隧菌體、鹽酸或次氯酸等的 方法，但使用亞硝酸的提取法最常見。
[0004] 利用亞硝酸的提取法具有糖多糖體的高提取效率和亞硝酸便宜且容易操作運樣 的優點，但亞硝酸自身為不穩定而易分解的化合物，因此，具有必須每次在提取前將亞硝酸 鋼和醋酸等有機酸混合，制備亞硝酸運樣的缺點。另外，在不斷地進行診斷的情況下，每次 都制備亞硝酸成為醫師及檢測技師的較大的負擔。此外，由于包括混合工序，因此也可能因 試劑的混合錯誤等而無法進行正確的安全診斷。
[0005] 為了克服該問題點，關于用于簡化從鏈球菌中提取多糖抗原的工序的簡便的檢測 工具也已持續進行研究開發。
[0006] 例如，在專利文獻1中，提出了一種從生物(特別是鏈球菌A組或B組)提取多糖抗原 的簡化的提取方法，其中，使用將W下物質組合而成的試劑盒:a.滲入測定量的亞硝酸鹽并 干燥的第一吸收性物質、b.滲入測定量的中和堿及緩沖液并干燥的第二吸收性物質、C.測 定量的酸的水溶液(參照專利文獻1)。
[0007] 另外，在鏈球菌感染的診斷時，需要首先進行多糖抗原的提取工序，接著使所得到 的溶液與免疫測定裝置接觸并進行抗原的檢測工序運樣的麻煩的處理工序，因此，包括多 糖抗原的提取工序及標記物的測定工序的對試樣中的生物簡便地進行測定檢測的方法W 及為此開發的試劑盒成為課題。
[000引例如，在專利文獻2中，公開了一種用于檢測鏈球菌科等的微生物/細菌性生物體 中特征性的碳水化合物抗原的分析裝置及方法。在該側向流動分析裝置中，提供了一種包 括具有W下部分的基材的裝置:a.樣品接收區、b.提取區（提取試劑；固定化或吸收并干燥 的酸及亞硝酸鹽）、c.中和劑（中和緩沖劑;TRIS)、d.檢測區（捕捉/檢測試劑）（參照專利文 獻2)。
[0009]進而，也開發了一種對含有鏈球菌的多種不同的生物同時進行測定檢測的方法W 及為此的試劑盒。
[0010] 例如，在專利文獻3中，其為一種對第一生物為革蘭氏陽性細菌(例如A、B、F或G組 鏈球菌、腸球菌細菌等）、第二生物為病毒類或革蘭氏陰性細菌類等運樣的試樣中的多種不 同的生物種進行測定的方法及試劑盒，可利用在一個W上的容器內具備W下物質的試劑盒 對多種檢體同時進行檢測:a.亞硝酸或干燥狀態的酸及亞硝酸鹽、b.表面活性劑、C.與從第 一生物得到的第一標記物結合的第一結合試劑、d.與從第二生物得到的第二標記物結合的 第二結合試劑，由此實現了檢測效率的倍增和患者檢測所伴隨的痛苦的減輕(參照專利文 獻3)。
[0011] 關于用于檢測鏈球菌科等的微生物/細菌性生物體中特征性的碳水化合物抗原的 分析裝置及方法，有已經上市出售的那些，例如作為免疫層析試劑，有夕^ッ夕t''二一 DipStickS化epA(DSフア一7パ斗才7^テV力/レ）及ス^レッフ°Aテスレ、°ッ夕·ククス0BC(Ξ 和化學研究所)等，另外，作為玻片乳膠聚集法試劑，已知有A鏈霉菌AD"生研"（テ'シ力生研） 等。
[0012] 對免疫層析試劑的市售品而言，通常為了在檢體的試驗中判定為陽性，需要在直 接法中溶血性鏈球菌濃度為1 X 106c即/mLW上。因此，在低于1 X 106CFU/mL的情況下，盡管 為陽性也會判定為陰性，另外，W不溶性載體標記抗體的免疫層析法檢測試劑與通常的EIA 相比靈敏度較低，因此，存在陽性的情況下所觀察的線不清晰運樣的問題，此外，存在盡管 試樣液中不存在被檢測物(抗原等)也判定為陽性的所謂產生假陽性運樣的問題。
[0013] 為了解決運樣的問題點，提供了一種使展開溶劑中存在糖或水溶性高分子化合物 的方法等。例如，在使用結合了抗體的著色乳膠顆粒的膜測定方法中，通過使用在乳膠組合 物中添加糖類(例如單糖類、寡糖W及它們的糖醇)及多元醇運樣的至少1種聚集抑制劑和 蛋白質且同時含有堿性的緩沖劑、且其抑為9.0~9.8的免疫測定用乳膠組合物，由此，可防 止乳膠顆粒的自然聚集，防止比重、粘度、浸透壓的上升，從而可W高靈敏度地進行免疫測 定(參照專利文獻4)。
[0014] 另外，最近提出有W下的方法:在作為適合糖尿病的診斷的指標被廣泛使用的血 中的血紅蛋白上結合有糖的糖化血紅蛋白、特別是血紅蛋白β鏈的N末端鄉氨酸殘基被糖化 的血紅蛋白Ale(稱為"HbAlc"。）的顆粒免疫層析測定方法中，（Α)將含有紅細胞的測定試樣 用表面活性劑處理使血紅蛋白β鏈的N末端露出在蛋白質表面，（B)使所得到的試樣與處于 水不溶性的狀態的環狀多糖類(例如利用化學鍵固定于膜等。環狀多糖類自身形成聚合物。 在多孔性樹脂中捏合的狀態)接觸，接著，（C)使所得到的試樣與識別由顆粒標記的血紅蛋 白的Ν末端的抗體等接觸從而進行檢測。運樣防止了環狀多糖類與水接觸時，構成環狀多糖 類的環狀寡糖分子或環狀多糖分子成為溶解于水中而不擴散的狀態，運是抗體彼此聚集而 不在膜上展開從而無法準確地測定的原因（參照專利文獻5)。
[0015] 進而，提出有一種在使用了膜測定方法的檢體的簡易的檢測方法中，可在保持靈 敏度的同時防止假陽性及堵塞的檢體試樣的過濾方法(參照專利文獻6)。
[0016] 然而，對用不溶性載體(金膠體顆粒、著色乳膠顆粒等)標記抗體的免疫層析法(也 稱為"顆粒免疫層析法"。）而言，有時根據測定試樣、測定環境、測定條件依然產生該不溶性 載體的聚集而引起非特異性反應，展開速度慢等問題有時無法解決。因此，期望在采用了各 種測定試樣、測定環境、測定條件的顆粒免疫層析法中，尋求一種不發生不溶性載體的聚 集、不會引起非特異性反應、展開速度快的檢測試劑。
[0017]現有技術文獻 [0018]專利文獻
[0019] 專利文獻1:日本特表平7-503543號公報
[0020] 專利文獻2:日本特表2008-509384號公報
[0021] 專利文獻3:日本特表2006-518990號公報（日本專利第4667874號公報）
[0022] 專利文獻4:日本特開2007-315883號公報
[0023] 專利文獻5:日本特開2012-251789號公報
[0024] 專利文獻6:日本特開2009-36781號公報
【發明內容】
[0025] 發明所要解決的課題
[0026] 本發明的目的及課題在于，提供一種在利用免疫層析法進行革蘭氏陽性菌、特別 是溶血性鏈球菌檢測時，通過對試樣提取(稀釋)液(也稱為"檢體處理液"、"展開液"。）進行 改良，由此，與現有技術相比，展開體系中的陰性檢體下的發色降低，陽性檢體下的發色提 高，即S/N較高的高靈敏度免疫層析用檢測試劑。
[0027] 另外，本發明的目的在于，提供一種在利用免疫層析法進行細菌檢測時，通過對展 開提取條件進行改良，由此，不會產生檢體中或免疫層析設備中存在的蛋白質成分在展開 檢測中變性/析出(沉淀)的、高靈敏度且展開速度快的檢測試劑。
[0028] 進而，本發明的目的在于，提供一種免疫測定用試劑、免疫測定方法、免疫層析檢 測方法及免疫層析試劑盒，其中，在利用免疫層析法進行細菌檢測時，通過對免疫層析試劑 盒的貼合部位的結構進行改良，由此，與現有技術相比，雖然迅速且高精度檢測試樣(例如 采自呼吸道疾病患者的檢體，特別是鼻涕、鼻拭子或疲等）中的微生物或者源自于微生物的 抗原或抗體等(例如革蘭氏陽性菌、特別是溶血性鏈球菌等細菌）、特別是溶血性鏈球菌檢 測需要利用亞硝酸提取多糖體，且作為不穩定的化合物的亞硝酸在每次檢測時均需要設置 使亞硝酸鹽與酸性溶液反應的亞硝酸生成工序運樣的繁瑣的用時制備，但無需每次都進行 用時制備來制備亞硝酸，通過在檢測設備上在環狀寡糖的存在下生成亞硝酸可W提高檢測 效率、檢測精度且省力。
[0029] 進一步詳細而言，本發明的目的在于，提供一種可迅速診斷呼吸系統感染癥之一 的A組的容血性鏈球菌的簡便且S/^比高的高靈敏度免疫層析用試樣提取液下也稱為"試 樣稀釋液"。）、免疫層析用試劑、使用其的免疫層析試劑盒及檢測方法。
[0030] 用于解決課題的手段
[0031] 本發明人等首次發現可W提供一種在用免疫層析法檢測試劑檢測細菌時，通過使 使用的試樣提取液中含有環狀寡糖和/或亞硝酸鹽、或者使位于免疫層析試劑盒中保持有 機酸的試劑保持部的試樣展開方向上游的其它試劑保持部含有環狀寡糖和/或亞硝酸鹽， 由此，即使作為試樣提取液的展開液因檢測設備展開中所保持的有機酸或生成的亞硝酸導 致pH條件發生變化，檢體或免疫層析設備中的蛋白質成分等也不會變性?析出而出現在判 定線上誘發非特異性的反應，且不會引起抗體固定顆粒膠體的聚集的、檢測精度下稱為 "S/N比"。）高的展開速度快的檢測試劑。
[0032] 提供一種在本發明的檢測體系中，通過添加環狀寡糖，即使在含有有機酸作為試 劑成分且產生亞硝酸運樣的展開/提取條件下也不會使提取液及檢體中的或者設備中的蛋 白質成分等析出從而能夠進行檢測的免疫測定用試劑、免疫測定方法及免疫層析試劑盒 等。
[0033] 本發明提供一種下述（1)~（19)的免疫層析法中使用的檢體處理液、免疫測定用 試劑、免疫測定方法、免疫層析檢測方法、免疫層析試劑盒、及使用其的免疫層析法。
[0034] 作為本發明的免疫測定方法，具有如下特征。
[0035] (1)本發明的第一特征為一種利用提取劑提取檢體中的待檢測物的抗原并進行檢 測的免疫測定方法，其特征在于，在環狀寡糖的存在下進行。
[0036] (2)本發明