癌關聯物質的拉曼定量方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種癌關聯物質的拉曼定量方法，其以伴隨癌的惡化而增加的血中的癌關聯物質、主要是游離DNA為對象。
【背景技術】
[0002]目前，作為癌的診斷方法之一，可使用檢測伴隨癌的惡化而在血液中出現、增加的癌關聯物質的方法。在此，癌關聯物質為從癌患者的體液中所提取的癌特有物質，一般是指在癌化的細胞被破壞的情況下游離于血液中的、源自該被破壞的癌細胞的蛋白質等。而且，在現有的癌的診斷方法中，在血液中的癌關聯物質的定量值為某種一定值以上的情況下，判定為受驗者存在患有癌的可能性。
[0003]作為因這樣癌化的細胞的破壞等而游離于血液中的癌關聯物質，已知有不僅蛋白質、而且DNA也同樣地游離。而且，報道有在健康人和癌患者中進行比較時，就血液中的源自癌細胞的游離DNA(CtDNA)的量而言，與健康人相比，癌患者的一方顯著地多。因此，認為通過將血液等的體液中的源自癌細胞的游離DNA進行定量，可以診斷受驗者是否患有癌，作為這種癌的診斷方法，例如提出了:通過聚合酶連鎖反應(PCR)法等擴增的200bp以上的DNA在被排出至體液或體外的糞便中等被檢出時，診斷為受驗者存在患有癌的可能性，進一步分析其DNA的變異的方法(專利文獻I);將體液等中所含的源自細胞殘渣的基因組DNA進行定量，在其值為某種一定值以上的情況下，進一步進行DNA檢查的方法(專利文獻2)。
[0004]但是，即使通過診斷而判明患有癌，僅將體液中的DN A進行定量，還不能特定癌產生的臟器。而且，已知有在癌產生的情況下，根據其產生的臟器而產生特異的DNA的變異。因此，通過明確DNA的變異的種類，存在可以特定癌產生的臟器的可能性。在此，作為DNA的變異，可列舉:DNA的點突變、染色體的缺失或擴增等結構異常。例如，已知有胰腺癌的約7成在K-ras基因中產生點突變。另外，在異質接合的缺失(Loss of heterozygous、以下，簡稱為L0H)的分析中，也報道有在各癌種中特異的染色體臂的缺損，例如在肺癌中，已知有在3號染色體的短臂上LOH集中。另外，在乳癌中，已知有8號染色體的長臂的擴增或RB2的擴增。因此，為了提供將源自癌細胞的DNA進行定量而高精度地進行癌的診斷的方法，提出了包含從受驗者中采取的血漿提取游離DNA的工序、將提取的游離DNA進行定量而算出每單位體積血漿的游離DNA的工序、將算出的游離DNA的算出值與第I閾值以上的第2閾值進行比較的工序、和在算出值低于第I閾值的情況下，判定為受驗者的患有癌可能性高，另一方面，第2閾值以上的情況下，源自正常細胞的DNA混入于血漿中的癌的診斷方法(專利文獻3)。
現有技術文獻專利文獻
[0005]專利文獻1:美國專利第6143529號說明書專利文獻2:美國專利2004/0259101A1號說明書專利文獻3:國際公開2008/090930號專利文獻4:日本特開2011-81001號公報
【發明內容】
發明所要解決的課題
[0006]但是，例如即使將全血中的源自癌細胞的游離DNA進行定量，其量也為微量，與此相對，在全血中大量地含有源自作為正常細胞的淋巴細胞的DNA。因此，即使從全血中直接提取DNA，也難以將源自癌細胞的游離DNA進行定量。因此，例如考慮使用從全血中分離的血漿提取血漿中的源自癌細胞的游離DNA并進行定量的方法，但通過DNA的提取方法，有時混入源自淋巴細胞等正常細胞的DNA，有時將不是源自癌細胞的游離DNA、而是將源自正常細胞的DNA進行定量，存在錯誤診斷癌的可能性。因此，在癌的正確的診斷中，準確地定量源自癌細胞的游離DNA(本發明中稱為纏繞于組蛋白的DNA)是重要的，如何簡單迅速地提取微量的游離DNA，如何除去源自正常細胞的DNA并提高游離DNA的檢測精度，如何精度好地檢測微量的DNA，在癌的適當的診斷中為必需的。
[0007 ]另一方面，作為分析血中的微量DNA的方法，有必要提供一種使用拉曼分光分析技法，定性及定量地檢測的手段，但SERS現象不僅I)機制不能完美地理解，而且2)準確地結構性地被定義的納米物質合成及控制困難、3)根據測定光譜時所使用的光的波長、偏光方向引起的增強效率的變化等，在再現性及可靠性方面應該解決的問題較多，在以納米-生物傳感器的開發及商用化為主的SERS現象的應用中作為大的課題殘留，提出了利用納米線和納米粒子的混合結構，達到生物體提取物及蛋白質、DNA那樣的生物分子的SERS信號的增強和測定的再現性、敏感度及可靠度提高的技術(專利文獻4)，但納米線和納米粒子的混合結構經由受體而使被測定對象吸附，因此，作為檢測微量的源自癌細胞的DNA的方法不適合。用于解決課題的技術方案
[0008]因此，本發明人等認為作為檢測對象，不經由受體而直接檢測容易發病癌或在發病時在血液中增加的癌關聯物質、例如源自癌細胞的游離DNA為最完善的方案，并進行了潛心研究。
[0009]在此，應該檢測的對象的游離DNA纏繞于相當于絲卷的組蛋白這樣的蛋白質，一個被纏繞的單元結構(I組)稱為核小體，將核小體聚集而成為繩索狀的結構稱為染色質(纖維)。而且，細胞癌化而重復分裂時，為了不讓對癌增加不利的基因(癌抑制基因)出來，牢固地纏繞于組蛋白并封蓋，為了對組蛋白的纏繞方式更緊，使DNA不能簡單地解開，引起甲基化的修飾，但通常組蛋白帶正電( + )，DNA帶負電(一)，兩者如磁鐵那樣互相粘在一起，而且進行甲基化而不能解開，纏繞于組蛋白的DNA帶有正電( + )(圖11(a)參照)。另一方面，由于乙酰化帶負電(一)，因此，通常如果(+ )正電的組蛋白進行乙酰化，則彼此均帶負電(一)，與DNA排斥。于是，成為DNA這樣的“絲”從組蛋白中解開而表達基因的機制(圖11(b)參照)。因此，為了選擇性地吸附源自癌細胞的游離DNA，由于纏繞于組蛋白的DNA帶有正電( + )，因此認為優選被吸附的基板帶有負電(一)。
[0010]另外，本發明人等將金屬絡合物水溶液在比形成絡合物的金屬低的電極電位(離子化傾向大的)金屬基板上利用電極電位差進行化學還原而使量子晶體(納米尺寸的金屬絡合物晶體)凝集。在銀絡合物的情況下，通過使硫代硫酸銀水溶液在比銀低的電極電位(離子化傾向大的)的銅或銅合金上凝集，采用化學還原法而形成銀絡合物的量子晶體。
詳細而言，金屬絡合物的水溶液中的濃度應該主要考慮形成的量子晶體的尺寸而確定，在使用分散劑時，也可考慮其濃度，通常可以在10ppm?5000ppm的范圍內使用，但也依賴于配體的功能，為了制備應該稱為納米簇的納米尺寸，優選500?2000ppm的濃度。形成量子晶體的金屬絡合物以具有與擔載金屬的電極電位E相關的式(I)所示的絡合物穩定度常數(1gP)以上的方式選擇。
式 a):E =(RT/|Z|F)ln(f3i)
(其中，E表示標準電極電位，R表示氣體常數，T表示絕對溫度，Z表示離子價，F表示法拉第常數。)
在此，金屬絡合物為選自Au、Ag、Pt或Pd中的等離子體金屬的絡合物的情況下，相對于拉曼光具有局部存在表面等離子體共振增強效果。特別是金屬絡合物為銀絡合物時，通過穩定度常數(生成常數)(logi3i)為8以上的銀絡合劑和鹵化銀的反應而形成即可，作為鹵化銀，優選氯化銀，作為絡合劑，優選為選自硫代硫酸鹽、硫代氰酸鹽、亞硫酸鹽、硫脲、碘化鉀、硫代水楊酸鹽、三聚硫氰酸鹽中的I種。銀絡合物具有由平均直徑為5?20nm的納米簇構成的量子點，量子晶體的尺寸成為100?200nm。
[0011]將所述的銀絡合物在鹵離子的存在下進行堿性處理(用次氯酸處理)時，通過以下的反應而形成以銀鹵化物為核含有過氧化銀、銀氧化物的復合物的針狀納米晶體群(圖9)，而且發現:在水中帶有(一)荷電，另一方面，由于纏繞于組蛋白而DNA帶有(+ )荷電(圖11(a))，因此，選擇性地吸附以該游離DNA為代表的帶有正電荷的癌關聯物質。而且發現:含有過氧化銀的銀氧化物的針狀納米晶體群通過激光的照射而被還原，析出金屬銀，因此，通過激光照射而顯示表面等離子體增強效果，可得