一種牛布魯氏菌elisa檢測試劑盒的制作方法
【技術領域】
[0001] 本發明設及蛋白質工程技術領域，具體地，設及一種W牛布魯氏菌外膜蛋白為檢 測抗原的牛布魯氏菌ELISA檢測試劑盒。
【背景技術】
[0002] 布魯氏菌病是一種在世界范圍內影響嚴重的人畜共患病。布魯氏菌病是由布魯氏 菌引起的，主要侵害動物的生殖系統，引起流產和不孕不育，帶來嚴重的經濟損失。確診布 病的診斷方法是對致病微生物的分離培養鑒定。
[0003] 目前在血清學診斷方法上，大部分都是基于檢測抗布魯菌脂蛋白（脂多糖，LPS)的 抗體，雖然虎紅平板凝集和補體結合實驗在世界范圍內最認可和接受的測試，但是由于實 驗結果有交叉性，實驗操作步驟繁瑣、費時等垢病，在實際操作中應用較少。ELISA檢測方法 易于操作，特異性、靈敏性高，在布魯菌血清學診斷中很有前景，但是基于布魯菌全菌作為 診斷抗原，不可避免出現假陽性、假陰性，造成誤判，并且基于檢測布魯氏菌LPS的化ISA方 法不能區分自然感染和疫苗感染的缺陷。因此很有必要研發一種既不使用全菌也不使用脂 蛋白LF*S的診斷抗原。
[0004] 外膜蛋白0MP，不僅是布魯氏菌結構蛋白和功能蛋白，而且也是布魯氏菌重要的抗 原和毒力因子，對維持布魯氏菌細胞膜的完整性和選擇性至關重要。然而遺憾的是在布魯 氏菌如何生存和致病力感染中，外膜蛋白0MP起到的作用尚未被人知曉。外膜蛋白0MP28已 經被全面的研究了，在作為化ISA診斷抗原上具有較好的反應原性和特異性，也可W作為候 選疫苗。但將0MP19、0MP22、0MP28多種蛋白混合后用于布魯氏菌的診斷還未有研究報道。
[0005] pCold-TF載體在His-tag序列和多克隆位點之間插入了TriggerF'actoHTF)基 因。Trigger化ctor是一種原核細胞的核糖體結合伴侶蛋白，能夠促進新生膚鏈的共翻譯 蛋白的可溶性。通過TF的可溶性標記功能和分子伴侶作用，可W使一些難W表達的基因獲 得更高概率的可溶性表達；pColdTF載體的啟動子為冷激蛋白CspA(Coldshock proteins),決定著目的基因表達過程中要采取15°C左右的低溫培養。低溫培養能降低蛋白 質合成的速率，改變多膚折疊的動力學，從而導致正確折疊的蛋白增加，運是pColdTF載體 的優點之一。
【發明內容】
[0006] 本發明的目的在于提供一種牛布魯氏菌化ISA檢測試劑盒。
[0007] 本發明通過W下技術方案實現:構建包含牛布魯氏菌外膜蛋白基因0MP19、0MP22、 0MP28的表達載體，通過將Ξ種基因的表達載體分別轉化入感受態細胞，得到牛布魯氏菌外 膜蛋白0MP19、0MP22、0MP28表達工程菌;經IPTG誘導表達;將表達產物過儀-NTA瓊脂糖樹脂 層析柱，洗脫得到純化的牛布魯氏菌外膜蛋白01口19、01口22、01口28。然后將純化的立種蛋白 按比例W混合后用于包被化ISA酶標板，作為檢測抗原，用于檢測牛布魯氏菌。
[000引本發明提供一種牛布魯氏菌化ISA檢測試劑盒，W牛布魯氏菌外膜蛋白0MP19、 0MP22、0MP28混合抗原作為化ISA酶標板的包被抗原。
[0009] 進一步地，本發明的試劑盒中，所述包被抗原是將濃度均為lyg/ml的0MP19、 0MP22、0ΜΡ28Ξ種蛋白按照體積比1:1:1混合得到。
[0010] 本發明的試劑盒還含有馬血清，牛布魯氏菌陰性、陽性血清，酶標二抗，洗涂液，酶 標抗體稀釋液，底物顯色液，終止液。
[0011] 本發明試劑盒所使用的牛布魯氏菌外膜蛋白0ΜΡ19通過W下方法制備得到：合成 0ΜΡ19基因，序列如沈QIDNO. 1所示;將0ΜΡ19基因與pCo1d-TF載體分別用BamH巧日趾01雙 酶切，將酶切后的0MP19基因與pCold-TF載體連接，轉化大腸桿菌感受態細胞得到重組表達 載體pCold-TF/0MP19;將重組表達載體pCold-TF/0MP19轉化入感受態細胞，制得牛布魯氏 菌外膜蛋白0MP19表達工程菌;經IPTG誘導表達;將表達產物過儀-NTA瓊脂糖樹脂層析柱， 洗脫得到純化的牛布魯氏菌外膜蛋白0MP19。
[0012] 所述0MP19基因是W布魯氏菌DNA為模板，SEQID^.7-8所示的引物進行?0?擴增 得到的。
[OOU]F〇mpi9 5'-cgcggatccATGGGAATTTCAAAAGCAAG-3'（沈QIDNO.7)
[0014] R〇mpi9 5'-ccgctcga巧CAGCGCGACAGCGTCAC-3'（沈QIDNO.8)
[0015] PCR反應條件為：95°C，5min; 95°C，30s，57°C，45s，72°C，Imin，35個循環；72°C， 1Omin，4°C保存。1.5%瓊脂糖凝膠回收目的基因片段。
[0016] 本發明試劑盒所使用的牛布魯氏菌外膜蛋白0MP22通過W下方法制備得到：合成 0MP22基因，序列如沈QID^.2所示;將01?22基因與口(：〇1(1-了。載體分別用8曰111刖和趾〇1雙 酶切，將酶切后的0MP22基因與pCold-TF載體連接，轉化大腸桿菌感受態細胞得到重組表達 載體pCold-TF/0MP22;將重組表達載體pCold-TF/0MP22轉化入感受態細胞，制得牛布魯氏 菌外膜蛋白0MP22表達工程菌;經IPTG誘導表達;將表達產物過儀-NTA瓊脂糖樹脂層析柱， 洗脫得到純化的牛布魯氏菌外膜蛋白0MP22。
[0017] 所述0MP22基因是W布魯氏菌DNA為模板，SEQID^).9-10所示的引物進行口〇?擴 增得到的。
[001 引F0mp225'-cgcggatccATGTTCAAGCGTTCTATC-3'（沈QIDNO.9),
[0019] R〇mp225'-ccgctcgagCTAGAATTTGTAGTTCAG-3'（沈QIDNO. 10);
[0020] PCR反應條件為：95°C，5min; 95°C，30s，57°C，45s，72°C，Imin，35個循環；72°C， 1Omin，4°C保存。1.5%瓊脂糖凝膠回收目的基因片段。
[0021] 本發明試劑盒所使用的牛布魯氏菌外膜蛋白0MP28通過W下方法制備得到：合成 0MP28基因，序列如沈QID^.3所示;將01?28基因與口(：〇1(1-了。載體分別用8曰111刖和趾〇1雙 酶切，將酶切后的0MP28基因與pCold-TF載體連接，轉化大腸桿菌感受態細胞得到重組表達 載體pCold-TF/0MP28;將重組表達載體pCold-TF/0MP28轉化入感受態細胞，制得牛布魯氏 菌外膜蛋白0MP28表達工程菌;經IPTG誘導表達;將表達產物過儀-NTA瓊脂糖樹脂層析柱， 洗脫得到純化的牛布魯氏菌外膜蛋白0MP28。
[0022] 所述0MP28基因是W布魯氏菌DNA為模板，SEQID^.11-12所示的引物進行?0?擴 增得到的。
[0023] F〇mp285'-cgcggatccATGAACACTCGTGCTAGC-3'（沈QIDNO.11),
[0024] R〇mp285'-ccgctcga巧TACTTGATTTCAAAAACG-3'（沈QIDNO. 12)。
[0025]下劃線出分別為BamHI、XhoI酶切位點。
[00%]PCR反應條件為：95°C，5min; 95°C，30s，57°C，45s，72°C，Imin，35個循環；72°C， 1Omin，4°C保存。1.5%瓊脂糖凝膠回收目的基因片段。
[0027] 本發明提供了牛布魯氏菌外膜蛋白0MP19、0MP22、0MP28的混合抗原在制備檢測牛 布魯氏菌試劑盒中的應用。
[0028] 本發明的化ISA檢測試劑盒可W彌補國內牛布魯氏菌檢定方法的不足。僅需要2個 小時就能測得結果（IDEXX試劑盒需要4小時左右才能測得結果），且檢測靈敏度、準確度高， 運用本發明檢測試劑盒檢測牛布魯氏菌最低檢測限為血清1:1600。在建立混合抗原化ISA 檢測方法過程中，為降低背景值，本發明使用了無關血清，即10%的馬血清作為封閉液，較 常用的封閉液5%脫脂乳、1%BSA，能夠大大降低背景值。本發明試劑盒便于操作、使用成本 低(本試劑盒耗材不超過500元，而購買IDEXX試劑盒的花費為3000元）、穩定性和重復性好， 適合大規模推廣應用。
【附圖說明】
[0029] 圖1為Ξ種牛布魯氏菌外膜蛋白基因的PCR擴增結果圖，其中Μ為化2000Marker， 泳道1、2、3分別為0MP28、0MP22、0MP19基因的PCR擴增電泳結果。
[0030] 圖2重組載體酶切鑒定圖，其中Μ為化2000Marker，泳道1、2、3分別為pCold-TF/ 0MP19、pCold-TF/0MP22、pCold-TF/0MP28 載體的雙酶切產物。
[0031] 圖3純