一種檢測小分子G蛋白Rap1活性的方法及試劑盒的制作方法
【技術領域】
[0001 ]本發明屬于分子生物領域，一種檢測小分子G蛋白Rapl活性的方法及試劑盒。
【背景技術】
[0002]小分子G蛋白RapI屬于Ras家族，其結構類似于Ras，當結合GTP后處于活性狀態(Rap 1-GTP )，結合GDP后則處于非活性狀態(Rap 1-⑶P)。在細胞內，Rap I通過Rap 1-GTP與Rapl-GDP之間的動態轉換起分子開關的作用，胞外信號通過特異性鳥嘌呤核苷酸交換因子調控Rap I與GTP結合，從而激活RapI ；胞內特異性GTP酶激活蛋白促進GTP水解，從而使Rap I失活。活化的Rapl信號通過其下游不同的信號分子調控不同的生物學功能。胞外刺激因子例如生長因子、細胞因子、趨化因子以及第二信使Ca2+、DAG、cAMP等，可通過鳥嘌呤核苷酸交換因子激活Rapl從而調控不同的信號通路;而活化的大麻素受體可以通過下調GTP酶激活蛋白使已被激活的Rapl信號始終處于激活狀態。因此，Rapl信號介導的生理功能呈現出多樣性，對細胞增殖、分化、粘附、迀移等起不同的調控作用。1^?1通過1^^/^孤1/2、？38/^^1(/CREB或PI3K調控腫瘤細胞的增殖，還能通過調節鈣粘著蛋白介導的細胞粘附作用而影響腫瘤細胞的浸潤和迀移；在淋巴系統中，Rapl的病理性持續激活導致骨髓白血病;在神經系統中Rapl信號能促進神經元極性建立和軸突生長，還能調節神經突生長。Rapl信號能夠調控神經突觸結構和功能的可塑性變化，與神經元的迀移也具有相關性。因此，檢測Rapl蛋白的活性對于了解腫瘤的增殖和迀移，以及研究其在神經系統中的功能具有重要意義。
【發明內容】
[0003]本發明的發明目的之一在于是提供一種檢測小分子G蛋白Rapl活性的方法，利用該方法可檢測組織或體外培養的細胞系中Rapl的活性水平。
[0004]本發明的目的之二在于利用上述方法檢測小分子G蛋白Rapl活性的的試劑盒。
[0005]為解決上述問題，本發明提供包含谷胱甘肽瓊脂糖凝膠珠、IPbuffer、SDS-PAGEloading buffer、蛋白酶抑制劑、磷酸酶抑制劑及可特異性結合Rapl-GTP的GST-RalGDS-RBD融合蛋白與可特異性識別Rapl抗體的試劑盒及檢測方法。
[0006]其技術解決方案如下:一種檢測小分子G蛋白Rapl活性的方法，根據人RalGDS基因的Rapl結合結構域(RBD)能夠特異結合Rapl-GTP的特性，構建GST-RalGDS-RBD原核表達質粒，經誘導純化得到GST-Ral⑶S-RK)蛋白，并利用GST pull-down和Western-Blot方法檢測小分子G蛋白Rapl活性的方法；
其具體步驟如下:
步驟I構建GST-Ral⑶S-RK)原核表達質粒
Ral⑶S是Rapl下游的效應因子，含有Rapl結合結構域(位于其798-885位氨基酸殘基)，可以直接結合Rapl-GTP。查詢NCBI數據庫中人RalGDS基因對應798-885位氨基酸殘基的編碼序列，對照原核表達載體PGEX-6P-1的多克隆位點(圖1所示)，選擇其中的BamH I和EcoRI位點作為酶切位點設計上游引物(S^CGCGGATCCGCGctgccgctctacaacd')和下游引物(57 - CCGGAATTCCGGtcagaagatgcccttggcaa-37 )，以人肝文庫為模版，PCR擴增得到目的片段。經過瓊脂糖凝膠電泳分離后用凝膠回收試劑盒回收，回收的目的片段和PGEX-6P-1空載體分別經BamH I和EcoR I雙酶切后，再次經過瓊脂糖凝膠電泳分離回收，回收的目的片段和載體以5:1的比例混合。然后用T4 DNA連接酶于16°C連接過夜，隨后用該體系轉化DH5a大腸桿菌，涂平板并挑選其中的陽性克隆，所選的陽性克隆經過限制性內切酶切后得到大約418bp的目的片段(圖2所示)XST-RalGDS-RBD原核表達質粒測序得到的目的片段和NCBI數據庫上的編碼序列完全一致(圖3所示)。這表明GST-RalGDS-RBD原核表達質粒構建成功。
[0007]步驟2 GST-RalGDS-RBD融合蛋白的原核表達和純化
用上述構建的GST-RalGDS-RBD質粒轉化BL21大腸桿菌，按1%轉接于100 mL LB培養基中，37°C 180 r/min振蕩培養至對數生長期(D6Qonm=0.6);隨后按100 μΜ/L終濃度加入IPTG，20°C 180 r/min振蕩誘導過夜;次日4°C 4000 rpm 1min離心收集菌液，將得到的大腸桿菌用30 mL緩沖液PB[30 mL PBS中含0.5 mM/L DTT^2 yg /mL Aprotimin、2 yg /mLLeupeptinU mM/L PMSFa mM/L Na3V04、10 mM/L NaF]重懸，然后高壓破碎，隨后超聲波進一步破碎。4°C 13000 rpm 1min離心裂解產物，取上清，將預先經過平衡的300 yL谷胱甘肽瓊脂糖凝膠珠與離心后得到的上清混合，4°C混旋轉2h，然后預冷的PB緩沖液洗滌谷胱甘肽瓊脂糖凝膠珠，利用洗脫緩沖液[5ml配方:250 yL 1M/L Tris-Cl，ph7.6、4.75mL超純水、0.0154g還原型谷胱甘肽]把GST-Ral⑶S-RBD從凝膠珠上洗滌下來。最后利用SDS-PAGE考馬斯亮藍染色方法檢測純化的GST-RalGDS-RBD融合蛋白(圖4所示，大小約40kDa)。
[0008]步驟3 使用GST pull-down和Western-Blot方法檢測Rapl的活性水平
將HEK293細胞接種于100 cm2培養皿，待細胞長到80%密度時，利用脂質體轉染質粒RaplV12 (rapl基因組成型活性形式，表達產物相當于Rapl-GTP)。2處后收集細胞，先用PBS洗一次，然后用IP buffer裂解液冰上裂解細胞，12000 rpm離心10 min，取上清，留取其中2 O %作為對照。轉染R a PIV12的細胞上清均分為兩份，分別與偶聯了 G S T空載體和G S T -RalGDS-RBD的谷胱甘肽瓊脂糖凝膠珠混合，置搖床上4°C混旋轉Ih，4°C 6000 rpm離心，用IP裂解液洗滌三次，最后用微量進樣器吸干Ep管內所有剩余液體，加入30 μ? SDS-PAGEloading buffer，煮沸10 min，最后通過western-blot檢測目標Rapl蛋白。結果如圖5所示，其中以GST空載體作為陰性對照，GST-Ral⑶S-RBD能夠與HEK293細胞中表達的Rapl-GTP發生相互作用，并且這種相互作用具有很強的特異性。
[OOO9 ]利用脂質體轉染質粒Rap IV12 (rap I基因組成型活性形式，表達產物相當于Rap 1-GTP)或RaplN17(rapl基因組成型失活形式，表達產物相當于Rapl-GDP)到HEK293細胞中。24h后收集細胞，先用PBS洗一次，然后用IP裂解液冰上裂解細胞，12000 rpm離心10 min，取上清，留取其中20%作為對照。偶聯了GST-RalGDS-RBD的谷胱甘肽瓊脂糖凝膠珠分別與轉染RaplV12的細胞上清和轉染RaplN17的細胞上清混合，置搖床上4°C混旋轉lh，4°C 6000 rpm離心，用IP裂解液洗滌三次，最后用微量進樣器吸干Ep管內所有剩余液體，加入30 μ? SDS-PAGE loading buffer，煮沸10 min，最后通過western-blot檢測目標Rapl蛋白。結果如圖6所示，GST-RalGDS-RBD能夠與HEK293細胞中表達的Rapl-GTP發生相互作用，但不和HEK293細胞中表達的Rap 1-GDP結合。本發明的基本原理
小分子G蛋白R a P I活性檢測試劑盒基于谷胱甘肽S轉移酶(g I u t a t h i ο n e S-transferase，GST)親和層析和GST pul Ι-down方法。首先利用重組技術將谷胱甘肽S轉移酶與含有Rapl結合區域(Rapl binding domain, RBD)的RalGDS-RBD融合。GST-Ral⑶S-RBD融合蛋白能通過GST與固相化在載體上的谷胱甘肽(Glutath1ne, GTH)親和結合，也可以通過Rapl結合區域結合Rapl-GTP。當GST-RalGDS-RBD融合蛋白親和結合在谷胱甘肽固化瓊脂糖凝膠珠時，該固相載體能把Rapl-GTP從細胞或組織裂解液中pul Ι-down下來。IP裂解液洗去未與固相載體結合的蛋白后，然后制成供SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳分離的蛋白樣品。利用Western Blot的檢測方法，使用Rapl抗體，S卩可特異性檢測病理組織或細胞中Rapl的活性水平。
[0010]本發明方法的優點:
1.本發明采用的檢測方法操作簡單，易于標準化。
[0011]2.本發明采用的GST-RalGDS-RBD融合蛋白純度高，特異性好。
[0012]3.本發明采用的磷酸酶抑制劑混合物能很好地抑制Rapl-GTP降解，從而保證實驗結果的真實性。
[0013]本發明試劑盒的組成:
I.GST-Ral⑶S-RK)融合蛋白
規格:600 yg，可供30次pulΙ-down實驗，蛋白純化濃度>75% (圖4所示)。
[0014]保存條件:溶解于50 mM Tris-HCl，10%甘油，0.02% NaN3中，保存在_80°C。用途:GST-RalGDS-RBD融合蛋白能通過GST與固相化在載體上的谷胱甘肽親和結合，也可以通過Rap I結合區域結合Rap 1-GTP。
[0015]1.1P buffer規格:200 ml
用途:1P buffer用于病理組織或細胞裂解，保存在4°C。
[0016]注:使用時加蛋白酶抑制劑cocktail (1:500)以及磷酸酶抑制劑。
[0017]1.Washing buffer
washing buffer用于洗滌谷胱甘肽瓊脂糖凝膠珠，保存在4°C。
[0018]注:使用時加蛋白酶抑制劑cocktail (1:500)以及磷酸酶抑制劑。
[0019]2.谷胱甘肽瓊脂糖凝膠珠規格:450 μ?,保存在4°C。
[0020]用途:作為固相載體，用于結合GST-RalGDS-RBD融合蛋白。
[0021]3.SDS-PAGE loading buffer規格:1 ml,室溫保存。
[0022]用途:含有4% SDS (w/v),2% glycerol和0.05%溴酚藍，用于蛋白制樣，保存在4?C。
[0023]4.Rap I 抗體
規格:ant1-Rapl (50 μ?, Sc~65,Santa Cruz公司)
用途:用于Western blot檢測。
[0024]5.蛋白酶抑制劑Cocktail (50 μ?)，保存在_20°C。
[0025]6.磷酸酶抑制齊IJ 500 mM NaF (100 μ1)、100 mM Na3V04 (100 μ?)，保存在