心血管疾病標記物palm及利用其的心血管疾病診斷方法
【技術領域】
[0001] 本發明設及一種對于屯、血管疾病為特異性的診斷標記物，設及一種在屯、血管疾病 患者的組織或血清中特異性增加表達的PALM(paralemmin)及利用其的屯、血管疾病診斷用 試劑盒。
【背景技術】
[0002] 屯、血管類疾病是全球導致死亡最多的疾病，根據世界保健機構的預測，屯、血管類 疾病今后也將是在全球提供最多死亡原因的疾病。2005年因屯、血管類疾病死亡的人數為 1750萬，運相當于全球死亡人數的30%。在運些死亡者中，760萬人死于屯、臟麻搏，57萬 人死于腦中風。在未采取恰當的措施的情況下，到2015為止估算每年有2千萬人死于屯、 血管類疾病，其中主要死于屯、臟麻搏與腦中風。屯、血管類疾病是因屯、臟與血管的障礙而引 起，特別是冠狀屯、臟疾病（屯、臟麻搏）、冠狀動脈疾病、血壓上升（高血壓）、末梢動脈疾病、 風濕性屯、臟疾病、先天性屯、臟病及屯、功能不全包含在所述屯、血管類疾病中。在屯、血管疾病 中占據重要部分的冠狀動脈疾病大致是因動脈硬化而向屯、臟供給血液的冠狀動脈堵塞或 變窄所導致。因動脈硬化導致冠狀動脈完全堵塞而屯、臟肌肉組織死亡的疾病為屯、肌梗塞， 冠狀動脈變窄而感覺到胸部壓迫管或胸痛的疾病為屯、絞痛。
[0003] 確認存在屯、血管疾病發病危險的個人是用W進一步有效地預防或治療所述疾病 的重要戰略。W往，只有屯、血管疾病發展到某種程度時方能通過物理方法診斷，從而早期診 斷或預測有限。通常，對于屯、血管疾病，利用造影裝備對屯、臟內部及冠狀動脈進行X射線及 超聲波拍攝而進行診斷，但運種方法僅可在發病后進行診斷。另外，目前在臨床上使用預測 可從血液樣品測定的屯、血管疾病的若干危險因數、例如與LDL(LowDensityLipoprotein， 低密度脂蛋白）及皿L化i曲DensityLipoprotein,高密度脂蛋白）膽固醇數值相關的因 數，但患有動脈粥樣硬化的許多患者并不具有運種危險因數。進而，未表現出運種危險因數 的許多個人也會發生屯、血管疾病，因此也考慮發生屯、血管疾病的危險較低的個人。因此，一 直W來要求一種對患者偵測發生屯、血管疾病的危險的方法。
[0004] 屯、血管相關疾病是毫無征兆地突發的疾病，因此與人的生命及日常生活的功能限 制具有非常密切的關聯性。因此，需要事先預測診斷運種已發展的屯、血管疾病而挽救患者 的生命并提高生活質量。作為迄今為止已知的屯、血管類疾病的生物標記物，有CRP、IL-6、 比-8、MCP-1、IP-10 等。除此之外，申請有與利用MCP-1、MCP-2、MCP-3、MCP-4、eotaxin、 M-CSF、比-3、IP-10、TNFa、Ang-2、比-5、比-7與IGF-1等的組合的屯、血管類生物標記物相 關的專利扣S2007/0099239)。然而，因各種檢查而醫療費增加，W所有人為對象進行W篩 查為目的的檢查有限，因此對可簡便地通過一次采血進行診斷的生物標記物的需求日益增 強。
[0005] 因此，本發明人等為了開發新穎的特異性屯、血管疾病標記物而進行努力，結果確 認到如下情況而完成了本發明：與正常組相比，PALM(paralemmin)在屯、血管疾病小鼠及患 者中呈增加的現象，與作為現有的屯、血管疾病標記物的CK-MB及troponin(肌巧蛋白）-T 的表達相似，由此可將所述PALM有效地用作屯、血管疾病標記物。
【發明內容】
[0006][發明要解決的問題] 陽007] 本發明的目的在于提供一種包含特異性地結合到PALM(Paralemmin)的抗體的屯、 血管類疾病診斷用試劑盒及用W提供診斷屯、血管疾病的信息的蛋白質檢測方法。
[000引[解決問題的技術手段]
[0009] 為了達成所述目的，本發明提供一種包含特異性地結合到PALM(Paralelllmin) 的抗體的屯、血管類疾病診斷用試劑盒。
[0010] 另外，本發明提供一種用W提供診斷屯、血管疾病的信息的蛋白質檢測方法，其包 含如下步驟： W11] 1)從患者的分離的試料測定PALM的表達量的步驟；及
[0012] 2)篩選所述步驟1)的蛋白質的表達量高于正常對照組的個體的步驟。 陽〇1引[發明效果]
[0014] 本發明設及一種作為屯、血管疾病診斷用生物標記物的PALM(paralemmin)，所述 PALM在屯、血管疾病小鼠及患者中呈增加的現象，與作為現有的屯、血管疾病標記物的CK-MB 及troponin-T的表達相似，因此可實現可通過簡單的采血而簡便地進行屯、血管類診斷或 判斷發展程度的效果，因此可有效地用作屯、血管疾病標記物。
【附圖說明】
[0015] 圖1是關于通過LAD (Xeft Anterior Descending,左前降支）結扎而構建屯、血管 疾病小鼠模型的圖。
[0016] 圖2是利用從屯、血管疾病小鼠模型獲得的組織或血清對在加載到凝膠后表達的 蛋白質進行染色的圖。
[0017] 圖3是使用利用從屯、血管疾病小鼠模型獲得的組織或血清的樣品進行質量分析 的結果。
[0018] 圖4是在屯、血管疾病小鼠中利用免疫印跡法對PALM(Paralemlllin)蛋白圖案進 行分析的圖。
[0019] 圖5是在屯、血管疾病患者中利用免疫印跡法對PALM蛋白圖案進行分析的圖。 陽020] 圖6是從屯、血管疾病患者的血清分析作為現有標記物的CK-MB及化oponin-T的 蛋白質圖案的圖。 陽021] 圖7是從屯、血管疾病患者的血清分析作為現有標記物的CK-MB及化oponin-T蛋 白質圖案的圖。 陽02引圖8是根據屯、血管疾病患者的血清而與現有標記物比較分析PALM(Paralemmin)蛋白圖案的圖。
【具體實施方式】
[0023] W下，詳細地對本發明進行說明。
[0024] 本發明提供一種包含特異性地結合到PALM(Paralemmin)的抗體的屯、血管類疾病 診斷用試劑盒。
[00巧]所述屯、血管類疾病診斷用試劑盒的特征在于，所述PALM在屯、血管類疾病患者中 增加表達量。
[00%] 所述抗PALM抗體均可使用通過注入PALM蛋白而制作的抗PALM抗體或市售的 抗PALM抗體，所述PALM優選為人PALM,更優選為具有記載為序列1的PALM氨基酸序列的PALM。另外，所述抗體包含可與多克隆抗體、單克隆抗體及表位（epitope)結合的片段等。
[0027] 多克隆抗體可通過向動物注射所述PALM蛋白并從所述動物進行采血而獲得包含 抗體的血清的W往的方法來生產。運種多克隆抗體可通過本技術領域人員所熟知的任一方 法純化，可從山羊、兔子、老鼠、大鼠、雞、綿羊、猴子、馬、豬、牛、狗等任意的動物宿主制造， 優選為W兔子為宿主，但并不限定于此。
[0028] 單克隆抗體可使用通過連續細胞株的培養生成抗體分子的任一技術來制造。作為 運種技術，包含融合瘤技術、人鼠B-細胞融合瘤技術及邸V巧psteinBarrvirus,埃-己 二氏病毒）-融合瘤技術，但并不限定于此化ohlerGetal.,化1:ure256:495-497, 1975; KozborDetal.,JImmunolMethods81;31-42, 1985;CoteRJetal.'Proc化tlAcad sci80:2026-2030,1983;及ColeSPetal.，MolCellBiol62:109-120,1984)。
[0029] 另外，可制造含有對所述PALM蛋白的特定結合位點的抗體片段。例如，可將抗體 分子分解成胃蛋白酶而制造F(油'）2片段，可通過還原F(油'）2片段的二硫橋鍵而制造F油 片段，但并不限定于此。作為其他方法，可使F油表達庫變小而迅速且簡便地鑒定所需的具 有特異性的單克隆F油片段（HuseWDetal.，Science254:1275-1281，1989)。
[0030] 為了使清洗或復合體的分離等后續步驟變容易，所述抗體可結合到固體基質 (solidsubstrate)。固體基質例如有合成樹脂、硝化纖維素、玻璃基板、金屬基板、玻璃纖 維、微細球體及微珠等。另外，在所述合成樹脂中，有聚醋、聚氯乙締、聚苯乙締、聚丙締、 PVDF任olyvinylideneFluoride,聚偏二氣乙締）及尼龍等。
[0031] 所述抗體可結合顯色酶、顯色物質、或巧光分子，可結合到配位體。所述顯色 酶優選為HRP化orseradishperoxidase,辣根過氧化酶）或堿性憐酸酶（a化aline phosphatase)。另外，所述顯色物