一種白介素6的檢測方法及其試劑盒的制作方法
【技術領域】
[0001]本發明屬于激素檢測技術領域，尤其涉及一種白介素6的檢測方法及其試劑盒。
【背景技術】
[0002]白細胞介素-6，簡稱白介素6(IL_6)，是一種細胞因子，屬于白細胞介素的一種。它是由纖維母細胞、單核/巨噬細胞、T淋巴細胞、B淋巴細胞、上皮細胞、角質細胞、以及多種瘤細胞所產生。IL-1、TNF-a，PDGF、病毒感染、雙鏈RNA及cAMP等，均可誘導正常細胞產生白介素6。白介素6能夠刺激參與免疫反應的細胞增殖、分化并提高其功能。白介素6(IL-6)是肝細胞產生急性期蛋白的最重要的調節物，天然狀態下是分子量為23-30KD的蛋白質，有不同程度的糖基化和多聚化，這種不勻性與活力及組織特異性有一定關系。除巨噬細胞外，IL-6可由許多其他細胞分泌，如纖維母細胞、內皮細胞等。人IL-6與C-反應蛋白(急性反應蛋白之一)、血清淀粉酶A、纖維蛋白原、肌球蛋白、銅蘭蛋白相互聯系。IL-6在肝外亦有廣泛作用，在肝臟，IL-6的作用是通過與其高親和力的特異性細胞表面受體結合而完成的。IL-6受體(IL-6R)屬免疫球蛋白超家族，IL-6R中僅一 80KD的部分為與I1-6結合所必需，配體/受體復合物與膜糖蛋白(gpl30)結合，參與生長信號的信息轉導。IL-6對肝細胞蛋白質合成的分子效應發生在RNA轉錄水平。星狀細胞是肝臟中IL-6的主要來源。細菌脂多糖是其有效的刺激劑。慢性肝病中IL-6水平上升，可導致一系列免疫功能紊亂及免疫病理反應，如上所述，IL-6又可稱為肝細胞刺激因子，可促進多種細胞增殖和分化，并通過白分泌負反饋環路抑制細胞增殖。
[0003]目前，國內白介素6的檢測主要采用進口試劑和免疫組化試劑，國內開發的試劑盒多采用化學發光方法和酶聯免疫法，這些方法檢測步驟多，引進的影響因素較多，檢測結果易造成偏差。
[0004]熒光層析免疫分析方法是一種微量分析方法，根據熒光強度，對物質進行定性或定量分析，具有高靈敏度、選擇性強、需樣量少和操作簡便等優點。中國專利公布號為CN104330551A的發明專利，公布了一種基于化學發光法的免疫熒光定量檢測白介素6的試劑盒，以異硫氰酸熒光素標記的白介素6包被抗體和堿性磷酸酶標記的白介素6標記抗體制備抗試劑，以抗異硫氰酸熒光素抗體偶聯羧基磁珠制得磁微粒試劑，雙夾心法結合白介素6，以新型化學發光底物ALPS為底物，用化學發光儀檢測發光強度進行定量。然而該試劑盒的制備步驟較復雜，需要成本較高，檢測時需要水浴、分離等過程，操作多，耗時長。中國專利公布號為CN103969438A的發明專利，采用定量夾心酶聯免疫方法檢測白介素6。然而該方法檢測步驟有酶標板的包被及封閉、標準品或被檢血清的處理、單克隆抗體檢測，檢測過程中孵化時間長、洗板次數多，需要配套設備和專業人員。
【發明內容】
[0005]本發明的目的是提供一種白介素6的檢測方法及其試劑盒，具有靈敏度高、準確度高、操作簡單、成本低等優點。
[0006]本發明通過如下技術方案實現上述目的:
[0007]—種白介素6的檢測方法，包括以下步驟:
[0008]I)探針墊的制備:在熒光膠乳微粒溶液中加入活化劑反應，離心、洗滌后得到活化的熒光膠乳微粒；
[0009]將白蛋白和羊抗兔IgG分別與活化的熒光膠乳微粒偶聯反應，得到白蛋白熒光膠乳微粒和羊抗兔IgG熒光膠乳微粒;將白蛋白熒光膠乳微粒溶液加入活化劑反應，離心、洗滌后得到活化的白蛋白熒光膠乳微粒；
[0010]將白介素6單克隆抗體與活化的白蛋白熒光膠乳微粒偶聯反應，得到白介素6單克隆抗體熒光膠乳微粒；
[0011]將白介素6單克隆抗體熒光膠乳微粒與羊抗兔IgG熒光膠乳微粒混合得到混合熒光膠乳微粒，隨后用熒光探針微球稀釋液稀釋，均勻噴在玻璃纖維上，烘干得到探針墊；
[0012]2)免疫層析試紙條的制備:將樣品墊、探針墊、硝酸纖維素膜、吸水紙依次貼在PVC襯板上，將白介素6單克隆抗體和兔IgG分別包被在硝酸纖維素膜的檢測線和控制線上，經干燥、切割后得到免疫層析試紙條；
[0013]3)樣品稀釋液的制備:樣品稀釋液為含有白蛋白、表面活性劑、分散劑和防腐劑的緩沖液；
[0014]4)樣品檢驗:取待檢測的血清、血漿或全血樣品加入至樣品稀釋液中，待混合均勻后加入至免疫層析試紙條上進行免疫層析反應;隨后在熒光檢測器下采用與熒光膠乳微粒相對應的發射光波長進行熒光檢測。
[0015]進一步的，所述步驟I)中，在發射光波長為500nm?590nm的帶有羧基或氨基的熒光膠乳微粒溶液中加入活化劑1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽和N-羥基硫代琥珀酰亞胺，室溫下反應0.5h?2h，離心、洗滌后得到活化的熒光膠乳微粒，其中，1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽與N-羥基硫代琥珀酰亞胺的重量比為1:6?1:1，1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽與熒光膠乳微粒的重量比為1:100?5:100;優選的，所述步驟I)中，在發射光波長為500nm?590nm的帶有羧基或氨基的熒光膠乳微粒溶液中加入活化劑1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽和N-羥基硫代琥珀酰亞胺，室溫下反應lh，離心、洗滌后得到活化的熒光膠乳微粒，其中，1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽與N-羥基硫代琥珀酰亞胺的重量比為1:3，1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽與熒光膠乳微粒的重量比為I: 100。
[0016]進一步的，所述白蛋白包括人血清白蛋白、牛血清白蛋白、羊血清白蛋白和鼠血清白蛋白中的任意一種。
[0017]進一步的，所述步驟I)中，白蛋白與活化的熒光膠乳微粒的混合比例為0.05:100?0.2:100，混合后室溫下偶聯反應Ih?5h，得到白蛋白熒光膠乳微粒;羊抗兔IgG與活化的熒光膠乳微粒的混合比例為0.05:100?0.2:100,混合后室溫下偶聯反應Ih?5h，得到羊抗兔IgG熒光膠乳微粒；白介素6單克隆抗體與活化的白蛋白熒光膠乳微粒的混合比例為
0.05:100?0.2:100,混合后室溫下偶聯反應Ih?5h，得到白介素6單克隆抗體熒光膠乳微粒;優選的，所述步驟I)中，白蛋白與活化的熒光膠乳微粒的混合比例為0.12:100，混合后室溫下偶聯反應3h，得到白蛋白熒光膠乳微粒;羊抗兔IgG與活化的熒光膠乳微粒的混合比例為0.12:100，混合后室溫下偶聯反應3h，得到羊抗兔IgG熒光膠乳微粒；白介素6單克隆抗體與活化的白蛋白熒光膠乳微粒的混合比例為0.12:100，混合后室溫下偶聯反應3h，得到白介素6單克隆抗體熒光膠乳微粒。
[0018]進一步的，所述步驟I)中，按2:1?6:1的比例混合白介素6單克隆抗體熒光膠乳微粒和羊抗兔IgG熒光膠乳微粒，得到混合熒光膠乳微粒，將混合熒光膠乳微粒用熒光探針微球稀釋液稀釋2?6倍，以2μ1/αιι?6μ1/αιι的速度均勻噴在寬度為0.7cm?1.3cm的玻璃纖維上，在37°C下干燥2h?6h得到探針墊。
[0019]進一步的，所述步驟I)中，所述熒光探針微球稀釋液為包括蔗糖、牛血清白蛋白和表面活性劑的緩沖液;所述緩沖液包括PBS緩沖液、Tr i s緩沖液、MES緩沖液、HEPES緩沖液中的一種或幾種，所述表面活性劑為吐溫20或吐溫80。
[0020]進一步的，所述步驟3)中，所述緩沖液為PBS緩沖液、Tris緩沖液、甘氨酸緩沖液、MES緩沖液、HEPES緩沖液中的一種或幾種;所述表面活性劑為吐溫20、吐溫80、曲拉通X-100或聚乙二醇;所述防腐劑為疊氮鈉或procline;所述分散劑為聚乙烯吡咯烷酮10K、聚乙烯吡咯烷酮40K或聚乙烯醇。
[0021]進一步的，所述步驟2)中，將樣品墊、探針墊、硝酸纖維素膜、吸水紙依次貼在PVC襯板上，采用劃膜噴金機將白介素6單克隆抗體和兔IgG分別包被在層析試紙的檢測線和控制線上，37°C干燥12h?36h后經切條機切割得到3mm?5mm寬度的免疫層析試紙條;優選的，將樣品墊、探針墊、硝酸纖維素膜、吸水紙依次貼在PVC襯板上，采用劃膜噴金機將白介素6單克隆抗體和兔IgG分別包被在層析試紙的檢測線和控制線上，37°C干燥24h后經切條機切割得到4mm寬度的免疫層析試紙條。
[0022]—種應用上述的白介素6的檢測方法的試劑盒，包括試劑盒體以及稀釋液瓶，所述試劑盒體包括PVC襯板以及固定在所述PVC襯板上的樣品墊、探針墊、硝酸纖維素膜和吸水紙，所述樣品墊搭接在所述探針墊上，所述探針墊和所述吸水紙分別搭接在所述硝酸纖維素膜的兩側，所述硝酸纖維素膜上設置有檢測線和控制線，所述檢測線和控制線內分別包被有白介素6單克隆抗體和兔IgG ；所述稀釋液瓶中存放有樣品稀釋液。
[0023]進一步的，還包括殼體，所述殼體上設置有加樣孔、檢測窗口、編碼區域和把手，所述加樣孔位于所述樣品墊處，所述檢測窗口位于所述檢測線和控制線處，所述編碼區域位于檢測窗口和把手之間，所述把手位于所述吸水紙處。
[0024]與現有技術相比，本發明的一種白介素6的檢測方法及其試劑盒的有益效果是:
[0025]I)本發明利用熒光免疫層析方法，實現了白介素6的體外定性定量檢測；
[0026]2)本發明的熒光免疫層析方法中，檢測線區域包被有能與白介素6形成復合物的白介素6單克隆抗體，配套探針則使用2種熒光膠乳微粒標記的白介素6單克隆抗體;控制線區域包被有兔IgG抗體，配套探針使用羊抗兔IgG抗體標記的2種熒光膠乳微粒，控制線與檢測線獨立反應，互不影