一種快速檢測副溶血性弧菌的熒光納米免疫層析試劑盒及制備方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及微生物致瀉性致病菌檢測領域，尤其涉及一種快速檢測副溶血性弧菌的熒光納米免疫層析試劑盒及制備方法。
【背景技術】
[0002]感染性腹瀉是一組由細菌、病毒、原蟲等多病原體引起的、以腹瀉為主的腸道傳染病，是長期以來危害人民群眾的常見病和多發病，廣泛流行于世界各地。由于該病發病率高、流行極其廣泛，影響人們的身體健康，給社會帶來沉重的經濟負擔，已成為全球尤其是發展中國家的重要公共衛生問題。據WHO估計，全世界每天約有數千萬人發病，每年腹瀉病例高達30?50億例次，有500?1 000萬病例因嚴重腹瀉而死亡，平均每天死亡2.5萬人，在我國，感染性腹瀉病的發病率一直位居腸道傳染病的首位。2006?2007年我國其它感染性腹瀉報告年均發病率為56.69/10萬，細菌性痢疾報告年均發病率為30.05/10萬。近年來爆發的感染性腹瀉病疫情顯示愈演愈烈之勢，2010年10月海地暴發霍亂疫情，全國報告近100萬病例，致死約7000人。2011年5月爆發于德國的出血性大腸桿菌感染疫情3個月內在德國造成50人死亡，3000多人感染，此次疫情同時波及歐洲和美國、加拿大等16個國家。隨著全球經濟一體化進程的加快，國際間人員交往和經濟貿易量增長快速，造成傳染病在國際間傳播流行的危險性急劇增加。因此，開展快速有效的致瀉性病原菌快速檢測工作對口岸衛生安全和社會穩定意義重大。
[0003]多種腸道細菌可通過繁殖或毒素造成感染性腹瀉。最常見的有志賀菌、沙門菌、彎曲菌、霍亂弧菌、副溶血性弧菌、致瀉性大腸艾希菌、梭狀芽胞桿菌、蠟樣芽胞桿菌、金黃色葡萄球菌及耶爾森菌等引起。副溶血性弧菌是一種嗜鹽性細菌。副溶血性弧菌食物中毒，是進食含有該菌的食物所致，主要來自海產品，如墨魚、海魚、海蝦、海蟹、海蜇，以及含鹽分較高的腌制食品，如咸菜、腌肉等。本菌存活能力強，在抹布和砧板上能生存1個月以上，海水中可存活47天。臨床上以急性起病、腹痛、嘔吐、腹瀉及水樣便為主要癥狀。本病多在夏秋季發生于沿海地區，常造成集體發病。由于海鮮空運，內地城市病例也漸增多。
[0004]目前以上致病菌檢測的方法主要是2大類:一是國標方法傳統培養鑒定法，二是不斷發展的快速檢測法。傳統培養鑒定法具有結果準確可靠，不需要復雜儀器等特點，但由于其檢測周期長、過程繁瑣、試劑繁多等缺陷，已遠遠不能滿足現代快速檢測的需要。基于免疫學、生物醫學、分子生物學方法原理的各種快速檢測法具有快速優點，但由于其需要昂貴的設備、需帶回專業實驗室檢測等缺陷，無法滿足現場檢測的需要。
[0005]磁性納米材料是當今世界領域的研究熱點之一，在高密度磁記錄、磁流體、磁傳感等方面得到廣泛應用。運用于生物醫學領域的納米材料被稱之為納米生物材料，磁性納米生物材料具有良好的磁導向性、生物相容性、生物降解性和活性功能基團等特點，由于其具有的生物活性、親和性、反應活性可結合各種功能分子如酶、抗體、細胞、DNA或RNA等，因而在靶向藥物、酶的固定化、免疫測定、細胞分離、分類等領域有廣泛應用。本發明技術利用磁性熒光納米顆粒連接副溶血性弧菌特異性抗體，通過磁性納米材料的富集功能，取代了傳統的增菌等前處理步驟;納米顆粒包裹了具有時間分辨熒光特性的鑭系金屬螯合物，使其具備極高的靈敏性，解決了免疫層析技術的定量檢測及副溶血性弧菌現場快速檢測的技術瓶頸問題。
【發明內容】
[0006]本發明所要解決的技術問題是克服現有技術的不足，提供一種快速、靈敏、簡便的檢測副溶血性弧菌的熒光納米免疫層析試劑盒，以及該試劑盒的制備方法。
[0007]本發明所述試劑盒所采用的技術方案是:所述試劑盒包括反應微孔試劑、免疫層析試紙條和副溶血性弧菌樣品稀釋液；
所述反應微孔試劑為密封有凍干的磁性熒光納米免疫復合微球和反應液混合物的酶標板微孔；
所述磁性熒光納米免疫復合微球為以Fe304為核心，內外包裹兩層二氧化硅，中間包裹一層稀土金屬銪離子螯合物的雙功能納米復合材料，納米材料表面偶聯抗副溶血性弧菌單克隆抗體；
所述反應液為含有Tris、HZT、BSA和Tween20的混合溶液。
[0008]進一步地，所述免疫層析試紙條包括PVC板;在所述PVC板上依次設置有吸水墊、硝酸纖維素膜和樣品墊，其中所述樣品墊上包括Tris、海藻糖、BSA、Tween20、NaCl、PVP-30，所述硝酸纖維素膜上包裹兔抗副溶血性弧菌多克隆抗體和羊抗鼠二抗。
[0009]另進一步地，所述副溶血性弧菌稀釋液為滅菌超純水。
[0010]本發明所述試劑盒的制備方法所采用的技術方案是，該方法包括反應微孔試劑制備步驟和免疫層析試紙條制備步驟；
所述反應微孔試劑制備步驟為:
(1)磁性熒光納米顆粒的修飾:將納米復合材料在氨基硅烷乙醇溶液中加熱回流12-24小時，用乙醇洗滌，再用戊二酸酐的二甲基飽和溶液重懸并室溫攪拌2-4小時，再次乙醇洗滌后用雙蒸水制成lmg/ml懸浮液保存，即為氨基化修飾的磁性焚光納米微球；
(2)制備磁性熒光納米免疫復合微球:取以上經修飾的熒光納米微球懸浮液按照1:11:4:4體積比與2-嗎啉乙磺酸(MES，50mmo 1 /L，pH6.0)、N-羥基硫代琥珀酰亞胺(NHS，1 OOmmo 1 /L)、1-(3-二甲氨基丙基)3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(EDC，100mmol/L)混合并室溫搖動反應30分鐘，離心棄去上清再以MES重懸，加入抗副溶血性弧菌單克隆抗體室溫反應1小時，加入等體積牛血清白蛋白-磷酸鹽緩沖液(BSA-PBS，pH6.0 )繼續反應1小時，離心棄去上清MES洗滌沉淀 3 次，并用 1 /3 體積 Tr i s-HCl (1 OOmmo 1/L，pH8.0 )重懸，4°C 保存；
(3)制備反應微孔:配制終濃度為lOOmMTrispH9.0、10%HZT、1%BSA、2%T_20的混合液與以上制備的免疫復合微球按照5:1體積比充分混合，加入酶標板反應微孔內，-80°C放置4小時以上，凍干機抽干；
免疫層析試紙條的制備步驟為:
(1)使用20mMTrispH8.0和2%海藻糖混合液將兔抗副溶血性弧菌多克隆抗體稀釋終濃度為9mg/ml，使用PBS、0.1%BSA和2%海藻糖混合液將羊抗鼠二抗稀釋為lmg/ml;
(2)使用噴膜儀將二者按照lul/cm噴于硝酸纖維膜上制得T線和C線； (3)再附以樣本墊、吸收墊、PVC底板制成免疫層析試紙條。
[0011]本發明的有益效果是:本發明通過對免疫功能化的時間分辨磁性熒光納米材料與副溶血性弧菌特異性的結合實現對副溶血性弧菌的分離和富集;所捕獲的待檢菌體再與免疫層析試紙條上的副溶血性弧菌特異性多克隆抗體結合，通過檢測在紫外燈下試紙條上熒光信號實現對樣本中待測菌的檢測。整個檢測過程簡便快捷，靈敏度高，成本低，可在20分鐘內完成。可適用于口岸檢疫部門、疾控中心等機構，為公共衛生安全提供技術保障。
【附圖說明】
[0012]圖1是免疫復合微球制備示意圖；
圖2是反應微孔及免疫層析試紙條結構示意圖；
圖3是樣品檢測示意圖；
圖4是在紫外光激發下的陰性、陽性對照結果。
【具體實施方式】
[0013]如圖1至4所示，在本實施例中，本發明所述試劑盒包括反應微孔試劑、免疫層析試紙條和副溶血性弧菌樣品稀釋液；
所述反應微孔試劑為密封有凍干的磁性熒光納米免疫復合微球和反應液混合物的酶標板微孔;所述磁性熒光納米免疫復合微球為以Fe304為核心，內外包裹兩層二氧化硅，中間包裹一層稀土金屬銪離子螯合物的雙功能納米復合材料，納米材料表面偶聯抗副溶血性弧菌單克隆抗體;所述反應液為含有Tris、HZT、BSA和TWeen20的混合溶液；
所述免疫層析試紙條包括PVC板a;在所述PVC板a上依次設置有吸水墊b、硝酸纖維素膜(:和樣品墊(1，其中所述樣品墊(1上包括1^8、海藻糖、834、了￥661120、他(:1、？￥?-30，所述硝酸纖維素膜c上包裹兔抗副溶血性弧菌多克隆抗體和羊抗鼠二抗；