豬圓環病毒2型競爭elisa抗體檢測試劑盒的制作方法
【技術領域】
[0001] 本發明設及一種試劑盒，特別設及一種豬圓環病毒2型競爭化ISA抗體檢測試劑 盒，屬于免疫學領域。
【背景技術】
[0002] 豬圓環病毒2型(Porcinecircovirustype2，PCV2)屬于圓環病毒科圓環病毒屬 成員，是迄今為止動物病毒中最小的病毒之一，直徑為17nm，二十面體對稱，無囊膜。病毒基 因組由單股閉合環狀DNA組成，含有1766~1769核骨酸（OlveraA，CorteyM，Segal自S J.Molecularevolutionofporcinecircovirustype2genomes:Phylogenyand clonality[J].Virology，2007,357(2):175~185;加angL.P.'LuY.H.'WeiY.W.'et al.Identificationofonecriticalaminoacidthatdeterminesaconformational neutralizingepitopeinthecapsidproteinofporcinecircovirustype2.BMC Microbiol. 2011a，11:188. )dPCV2基因組主要包含2個大的開放閱讀框架(ORFl和0RF2) (CheungAΚ.Transcriptionalanalysisofporcinecircovirustype2.Virology, 2003,305:168-180. )d0RF1編碼復制酶相關蛋白，參與病毒的復制，0RF2編碼Cap蛋白，是病 毒的唯一結構蛋白，具有良好的免疫原性，是該病毒診斷方法研制的理想靴抗原化iuC， IharaT，NunoyaT，etal.DevelopmentofanELISAbasedonthebaculovirus-expressedcapsidproteinofporcinecircovirustype2asantigen[J].JVetMed Sci. ,2004,66(3) :237~242.)。雖然PCV2只有一個血清型，然而卻分為多種基因型，包括 PCV2a、PCV化、PCV2C和PCV2d等。這些基因型的差異使其Cap蛋白抗原性存在差異dPCV2多抗 不能識別這些差異，只有單抗可W區分（SahaD.，HuangL.P.，BussalleuE.，et al.Antigenicsubtypingandepitopes'competitionanalysisofporcine circovirustype2usingmonoclonalantibodies.Vet.Microbiol.2012，157:13-22; HuangL.P.，LuY.H.，WeiY.W.，etal.Identificationofonecriticalaminoacid thatdeterminesaconformationalneutralizingepitopeinthecapsidprotein ofporcinecircovirustype2.BMCMicrobiol.2011a,11:188.)〇
[0003] PCV2是引起臨床上發生PMWS疾病的主要病原體，但其致病機制尚未完全闡明。 Meerts等（PeterMeerts，GeraldMisinzo，DavidLefebvre，JensNielsen，Anette Botnet；CharlotteSKristensen,HansJNauwynek.Correlationbetweenthe presenceofneutralizingantibodiesagainstporcinecircovirus2(PCV2)and protectionagainstreplicationofthevirusanddevelopmentofPCV2-associateddiseased].BMCVetRes2006,2:6-16.)研究表明，豬體內缺乏PCV2中和抗 體與病毒復制能力增強有關，因體內中和抗體效價較化，不能夠完全中和體內病毒增殖，最 終發展成為臨床raws疾病。為了進一步證實這種觀點，Fort等(FortM，01veraA，Sibila Μ,SegalesJ，MateuE:Detectionofneutralizingantibodiesinpostweaning multisystemicwastingsyndrome(PMWS)-affectedandnon-PMWS-affectedpigs[J] .VetMicrobiol2007，125 : 244-255.)進行了系統試驗，應用血清中和試驗、IPMA和定量PCR檢測PMWS豬、沒有PMWS表現而PCV2陽性豬W及PCV2陰性豬，結果發現：中和抗體與血清 中病毒載量呈負相關，中和抗體增長的同時病毒數量明顯下降;PMWS豬血清中和抗體水平 明顯低于沒有PMWS表現而PCV2陽性豬。可見中和抗體在清除血液循環中PCV2和疾病康復過 程中發揮重要作用。因此，體液免疫在PCV2相關疾病方面可能占有重要地位。
[0004] 用于PCV2血清抗體檢測的方法主要IIF、IPMA、間接化ISA、阻斷化ISA、競爭化ISA 和免疫膠體金技術等，其中WIIF和IPMA最為經典和常用，盡管運兩種方法具有諸多優點， 但是在結果判定方面存在一定的主觀性，難于實現高通量和自動化檢測需要使其推廣受到 限制。基于重組蛋白建立的間接化ISA具有較好的特異性，但其敏感性低于IPMA(張朝霞， 長明，危艷武，等，豬圓環病毒2型化ISA抗體檢測試劑盒的研制及應用[J].中國預防獸醫學 報，2008,30(7): 548-551;張志慧，危艷武，吳洪麗，等，豬圓環病毒2型幾種化ISA抗體檢測 試劑盒的比較與應用[J].中國預防獸醫學報，2014,36(2) :129-133),上述幾種方法檢測結 果不能直接反應PCV2中和抗體。本發明利用PCV2中和性單抗建立的競爭ELISA法可W直接 檢測血清中和抗體，具備規模化批量生產的優勢，可實現自動化檢測要求，特異性強，敏感 性與IPM相當，為該病毒疫苗免疫及臨床發病動物血清抗體的檢測提供了一種有效手段。
【發明內容】
[0005] 本發明的第一個目的在于提供一種豬圓環病毒2型競爭化ISA抗體檢測試劑盒，該 試劑盒操作簡便，特異性好，敏感性高，為PCV2流行病學調查及血清抗體檢測提供了 一種有 效技術手段；
[0006] 本發明的第二個目的在于提供一種使用W上所述的試劑盒在制備檢測豬血清豬 圓環病毒2型抗體試劑中的應用；
[0007] 本發明的第Ξ個目的在于提供用于建立W上所述試劑盒的單克隆抗體及分泌該 單克隆抗體的雜交瘤細胞株。
[0008] 為了實現本發明的目的，本發明提供了如下技術方案：
[0009] 本發明W純化的PCV2作為免疫原，分別對6周齡雌性BALB/c鼠進行3次免疫。首免， 每只鼠注射腹腔50yg(0.5ml)的純化病毒；間隔3周進行二免，免疫原、劑量和方法同上;再 間隔2周相同方法加強免疫。
[0010] 按常規方法無菌采取免疫鼠脾細胞，用PEG1450進行融合。采用IPMA方法篩選抗 PCV2單抗，具體操作方法參照文獻巧IJ長明，張超范，危艷武，等.豬圓環病毒2型免疫過氧化 物酶單層細胞試驗抗體檢測試劑盒的研究與應用[J].中國預防獸醫學報，2007,29(8):621 ~6 2 4 .)，雜交瘤上清液作為一抗，ΗRP標記的兔抗鼠IgG巧+L)作為檢測二抗，經檢測，將 IPMA檢測為陽性的雜交瘤細胞擴大培養，同時用有限稀釋法進行陽性雜交瘤細胞的克隆， 克隆3次，將獲得的陽性雜交瘤細胞及時凍存。
[0011] 經IPMA檢測篩選，獲得1株分泌抗豬圓環病毒2型單克隆抗體的陽性雜交瘤細胞 株，命名為PCV2-Cap-3A5,分類命名為分泌抗PCV2-Cap-3A5單克隆抗體的雜交瘤細胞株。保 藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中屯、，地址在北京市朝陽區北辰西路1號 院中科院微生物研究所，其微生物保藏號為：CGMCCNO.10205，保藏時間為2014年12月22 曰。
[0012] 進一步的，本發明還提供了由所述的雜交瘤細胞株分泌產生的單克隆抗體。
[0013] 本發明利用得到的單克隆抗體建立了一種豬圓環病毒2型競爭化ISA抗體檢測試 劑盒，其特征在于，包括采用間接的捕獲包被法包被豬圓環病毒2型抗原的酶標板和酶標記 的抗豬圓環病毒2型化P蛋白單克隆抗體。
[0014] 所述的單克隆抗體由雜交瘤細胞株分泌產生，所述的雜交瘤細胞株命名為PCV2-Cap-3A5,保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中屯、，保藏編號為CGMCC NO.10205。
[0015] 在本發明中，優選的，所述采用間接的捕獲包被法包被抗原為先用豬圓環病毒2型 陽性血清包被ELISA板W捕獲豬圓環病毒2型抗原;所述豬圓環病毒2型抗原為PCV2/LG株培 養物，毒價為1Xl〇5TCI化o/ml;所述酶為辣根過氧化酶。
[0016] 在本發明中，優選的，所述豬圓環病毒2型陽性血清的包被稀釋倍數為1:1000;所 述捕獲豬圓環病毒2型抗原的作用時間為化。
[0017] 在本發明中，優選的，所述試劑盒還包括陰性對照、陽性對照、稀釋液、顯色液、洗 涂液和終止液。
[0018] 在本發明中，優選的，所述陰性對照為豬圓環病毒2型陰性血清;所述陽性對照為 豬圓環病毒2型陽性血清;所述稀釋液為含有1%牛血清白蛋白的PBST緩沖液;所述顯色液 為ABTS工作液;所述洗涂液為PBST緩沖液;所述終止液為1 %的NaF溶液。
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