檢測貓毛過敏原特異性IgE抗體的試劑盒及方法
【技術領域】
[0001] 本發明屬于醫療器械生物類免疫體外診斷領域，特別是設及一種貓毛過敏原特異 性I巧抗體的試劑盒及方法。
【背景技術】
[0002] I巧抗體介導的I型過敏反應性疾病相當普遍，世界各國變態反應疾病的總發病率 約為15%-30%，我國大約有5-10%的人受過敏原的襲擾，是當前世界性的重大衛生學問題，被 世界衛生組織(WHO)列為二十一世紀重點防治的Ξ大疾病之一。
[0003] 過敏性疾病是患者吸入、攝食入或者注入含有致敏成分的物質（稱為過敏原或變 應原，Allergen)后觸發機體的B細胞產生特異性免疫球蛋白E(ImmunoglobulinE,IgE)， 從而引發過敏反應(或稱變態反應，Allergy)的疾病及相關癥狀，如過敏性哮喘、枯草熱、等 麻疹、過敏性鼻炎、濕疹、結膜炎及胃腸道I型過敏性疾病及嚴重過敏反應等。上述過敏性疾 病的發生，I巧抗體起關鍵作用。
[0004] 在國內，貓毛過敏原特異性I姐抗體(E1)檢測臨床上主要W國外進口試劑和免疫 組化試劑應用為主，國外進口試劑價格非常昂貴，給患者帶來很大的經濟負擔，不利于在基 層普及。具有自主知識產權的國產貓毛過敏原特異性I巧抗體(E1)免疫化學發光檢測試劑 盒目前還沒有。
[0005] 因此，有待開發對貓毛過敏原特異性I姐抗體(E1)檢測靈敏度高與可靠性并能降 低檢測成本的檢測技術。
【發明內容】
[0006] 本發明主要解決的技術問題是提供一種檢測貓毛過敏原特異性I巧抗體的試劑盒 及方法，該試劑盒性能可靠，靈敏度高，線性范圍寬，可配合全自動儀器使用，能提高檢測靈 敏度及可靠性，并降低成本，延長有效期。
[0007] 為解決上述技術問題，本發明采用的一個技術方案是：提供一種檢測貓毛過敏原 特異性I巧抗體的試劑盒，包括的試劑有:校準品、質控品、生物素標記的貓毛過敏原溶液、 堿性憐酸酶標記的鼠抗人I巧二抗溶液、鏈霉親和素標記的納米磁微粒懸浮液。
[000引在本發明一個較佳實施例中，所述生物素標記的貓毛過敏原溶液的濃度為0.1~ 1.0ug/ml，所述鏈霉親和素標記的納米磁微粒懸浮液的濃度為0.1~1.0mg/ml，所述堿性 憐酸酶標記的鼠抗人I巧二抗溶液的濃度為0. ^2.0ug/ml。
[0009] 在本發明一個較佳實施例中，所述校準品的濃度為：0IU/ml、0.35IU/ml、0.7 IU/ml、3.5IU/ml、17.5IU/ml、50IU/ml、100lU/ml，所述校準品是IgE蛋白與O.IM、抑值 為7.4的化is-肥1緩沖液配制得到的；所述質控品的濃度為:0.7lU/ml、17.5lU/ml，所述 質控品是I巧蛋白與0.lM、pH值為7.4的化is-HCl緩沖液配制得到的。
[0010] 在本發明一個較佳實施例中，所述貓毛過敏原為能與人體內貓毛特異性I巧蛋白 結合的抗原，所述生物素標記的貓毛過敏原的制備過程為:將貓毛過敏原按1:20摩爾比加 入到溶于二甲基甲酯胺的生物素中，再用0.1M、pH值為7.4的憐酸鹽緩沖液透析得到。
[0011] 在本發明一個較佳實施例中，所述標記的鼠抗人I巧二抗為能與人體內I巧蛋白特 異結合的抗體，所述堿性憐酸酶標記的鼠抗人I巧二抗的制備過程為:將濃度為1.0-5.Omg/ mL的堿性憐酸酶溶液與鼠抗人I巧二抗按摩爾比為2-10:1進行混合后并純化，得到堿性憐 酸酶標記的鼠抗人I巧二抗，所述純化是用抑為8-9的碳酸氨鹽緩沖液平衡并洗脫，再紫外 檢測和記錄純化圖譜，再用0.05M、抑值為6.0的MES緩沖液對堿性憐酸酶標記的鼠抗人IgE 抗體稀釋。
[0012] 在本發明一個較佳實施例中，所述鏈霉親和素標記的納米磁微粒懸浮液的制備過 程為:將鏈霉親和素標記的納米磁微粒用磁分離器沉淀，再用0.01M、pH值為7.4的憐酸鹽緩 沖液重懸，混勻磁分離沉淀，并重復清洗，清洗后的納米磁微粒分散于0.01M、pH值為7.4的 憐酸鹽緩沖液。
[0013] 提供一種納米磁微粒化學發光法定量檢測血清貓毛過敏原特異性I扣抗體的方 法，包括步驟為： (1) 將磁微粒試劑、生物素標記的貓毛過敏原和待檢樣本混勻并反應，反應后置于磁場 中靜置并去上清，得到第一溶液； (2) 向所述第一溶液中加入堿性憐酸酶標記的鼠抗人I巧二抗混勻并反應，反應后置于 磁場中靜置并去上清，得到第二溶液； (3) 向所述第二溶液中加入發光底物并反應，測發光強度； (4) 利用已知濃度的校準品繪制發光強度標準曲線，根據步驟(3)得到的發光強度對照 所述標準曲線，計算得出待測血清樣本中貓毛特異性I巧的含量。
[0014] 在本發明一個較佳實施例中，步驟（1)中所述反應的條件為37°C下反應15分鐘，所 述靜置的時間為3分鐘；步驟（1)中還包括對所述第一溶液用清洗液進行清洗，置于磁場中 靜置并去上清，清洗重復2次;步驟(2)中所述反應的條件為37°C下反應15分鐘，所述靜置的 時間為3分鐘；步驟(2)中還包括對所述第二溶液用清洗液進行清洗，置于磁場中靜置并去 上清，清洗重復2次;步驟(3)中所述反應的條件為37°C下反應5分鐘，在化學發光分析/測定 儀中測定發光強度。
[0015] 在本發明一個較佳實施例中，所述方法在全自動化學發光儀Lumiray系列上進行， 所述Lumiray系列為Lumiray1200、Lumiray1220、Lumiray1260或Lumiray1280。
[0016] 在本發明一個較佳實施例中，所述方法包括的步驟為： (1) 將所述試劑盒放入全自動化學發光儀的試劑倉里并進行識別； (2) 將校準品置于所述全自動化學發光儀的儀器樣本倉，識別校準品信息，分配校準品 位置； (3) 將質控物或待測樣本置于儀器樣本倉，編輯檢測信息； (4) 啟動運行程序，所有校準品/質控物/待測樣本自動進行處理得到結果。
[0017] 本發明的有益效果是:本發明的檢測貓毛過敏原特異性I巧抗體的試劑盒及方法， 試劑盒中各試劑組分穩定性良好，有效期可至一年W上，檢測靈敏度高、特異性能好、變異 小。經過大量實驗的工藝優化，得到完善統一工藝，并嚴格按照標準生產操作規程和質量控 制規程進行生產。用戶僅需按照操作說明進行規范操作，就可得到可靠的結果。在臨床研究 中與國外進口試劑的符合相關性高達90%W上，且費用僅為其1/2。
【附圖說明】
[0018] 為了更清楚地說明本發明實施例中的技術方案，下面將對實施例描述中所需要使 用的附圖作簡單地介紹，顯而易見地，下面描述中的附圖僅僅是本發明的一些實施例，對于 本領域普通技術人員來講，在不付出創造性勞動的前提下，還可W根據運些附圖獲得其它 的附圖，其中： 圖1是本發明的實施例一中檢測貓毛過敏原特異性I巧抗體(E1)的試劑盒的標準曲線 圖； 圖2是本發明的貓毛過敏原特異性I姐抗體(E1)檢測試劑盒與進口試劑的性能對比 圖。
【具體實施方式】
[0019] 下面將對本發明實施例中的技術方案進行清楚、完整地描述，顯然，所描述的實施 例僅是本發明的一部分實施例，而不是全部的實施例。基于本發明中的實施例，本領域普通 技術人員在沒有做出創造性勞動前提下所獲得的所有其它實施例，都屬于本發明保護的范 圍。
[0020] 實施例一： 提供一種基于納米磁微粒全自動化學發光法定量檢測貓毛過敏原特異性I姐抗體(E1) 的試劑盒，包括如下試劑： (1) 生物素標記的貓毛過敏原溶液，濃度為0.1-1.0ug/mL; (2) 鏈霉親和素標記的納米磁微粒懸浮液，濃度為0.1-1.0mg/mL; (3) 堿性憐酸酶標記的鼠抗人I巧二抗溶液，濃度為0.1-2.0Ug/mL; (4) 6個不同濃度水平的校準品：0IU/ml，0.35IU/ml，0.7IU/ml，3.5IU/ml，17.5 IU/ml,50lU/miaOOlU/ml； 巧)2個不同濃度水平的質控品:0.7IU/ml，17.5lU/ml。
[0021] 實施例二： 本發明提供的一種納米磁微粒全自動化學發光法定量檢測血清貓毛過敏原特異性IgE抗體試劑盒的制備包括如下步驟： (1)配制緩沖液： 配制0.01M、pH值為7.4的憐酸鹽緩沖液，0.lM、pH值為7.4的Tris-肥1緩沖液，0.05M、pH值為6.0的MES緩沖液。
[0022] 0.01M、pH值為7.4的憐酸鹽緩沖液的配制：取容量1L的燒杯，加入800ml去離子水， 稱取2.56g化抽Κ)4·12出0、0.44g化出Κ)4·2此0和9g化C1，加入到燒杯中，攬拌使其充分溶 解，用HC1或化0H調節pH值至7.4 ± 0.05，加入質量分數為2%的甘露醇、質量分數為1 %的甘 油，攬拌0.化至完全溶解，加去離子水定容至1L。
[0023] 0.1M、pH值為7.4的Tris-HCl緩沖液的配制：取容量1L的燒杯，加入800ml去離子 水，稱取12.11gTriS(Ξ徑甲基氨基甲燒)加入到燒杯中，攬拌使其充分溶解，用肥1或化0H 調節抑值至7.4±0.05，加入質量分數為2%的BSA、質量分數為0.3%的Proclin300，攬拌 0.化至完全溶解，加去離子水定容至1L。
[0024] 0.05M、pH值為6.0的MES緩沖液的配制：取容量IL的燒杯，加入800ml去離子水，稱 取9.76gMES(2-(N-嗎嘟代）乙橫酸）、9g化C1加入到燒杯中，攬拌使其充分溶液，用肥1或 化0H調節pH值至6.0 ± 0.05，加入質量分數為1%的BSA、質量分數為0.1%的Tween-20，攬拌 0.化至完全溶解，加去離子水定容至1L。
[0025] (2)制備生物素標記的貓毛過敏原溶液 將貓毛過敏原Wl:20的比例加入到溶于二甲基甲酯胺的生物素中，室溫條件下充分混 合反應30分鐘，反應后的溶液用0.lM、pH值為7.4的憐酸鹽緩沖液透析。BCA法測定生物素標 記的貓毛過敏原溶液的濃度，并調整其濃度到0.1-1.0ug/ml。
[00%] (3)制備鏈霉親和素標記的納米磁微粒懸浮液 將鏈霉親和素標記的納米磁微粒用磁分離器沉淀出來，用0.01M、pH值為7.4的憐酸鹽 緩沖液重懸，充分混勻15分鐘后磁分離沉出，棄去上清，再用0.01M、pH值為7.4的憐酸鹽緩 沖液重懸，如此重復清洗5次，清洗后的納米磁微粒分散于0.01M、pH值為7.4的憐酸鹽緩沖 液，濃度為〇.1-1.〇111旨/1111。
[0027] (4)制備堿性憐酸酶標記的鼠抗人I巧二抗溶液； 用0.0