基于磁珠包被抗體的微流控芯片及捕獲心肌標志物的方法
【技術領域】
[0001 ] 本發明涉及免疫磁珠包被結合抗體領域，尤其涉及一種基于磁珠包被抗體的微流 控芯片及捕獲心肌標志物的方法。
【背景技術】
[0002] 目前，微流控技術在生化分析、免疫診斷、環境檢測等領域具有重要進展，如在精 細控制流速的前提下，控制抗原抗體反應，從而達到對免疫反應的高靈敏度控制。通過范德 華力、靜電吸附、高分子包埋等手段心肌抗體被包被于反應微室中，進行抗原捕獲。為達到 即時檢測的目的，微通道中通過高傳質達到免疫底物充分的混合，進而存在包被抗體復溶 于流體系統及被流體中抗原捕獲脫離包被基材等問題。
【發明內容】
[0003] 本專利目的是提供一種基于磁珠包被抗體的微流控芯片及捕獲心肌標志物的方 法，高靈敏度地捕獲樣本中心肌標志物（抗原）的存在。通過對樣本進行預處理和平衡，如 紅細胞的去除、pH平衡、本底背景消除，最后獲得體系相似的反應體系進入檢測室進行目標 捕獲，防止包被抗體復溶于流體系統及被流體中抗原捕獲脫離包被基材。
[0004] 為達到以上目的，本申請采用免疫磁珠捕獲法，實現微流控芯片和基于該芯片的 捕獲心肌標志物的方法。免疫磁珠捕獲法是一種將磁珠磁場響應能力與免疫特異性相結合 的新型免疫學技術。免疫磁珠具有固相化試劑特質及免疫學反應高靈敏度、高專一性等優 點，在免疫學檢測、微生物檢測、細胞分離等領域廣泛應用。利用合成結構含鐵，免疫磁珠可 被磁場牽引，其表層具有特異性功能團，可與具有生物活性蛋白進行化學基團的共價結合， 作為抗體承載體。免疫反應中磁珠包被抗體與具有契合決定簇的抗原結合，從血漿等復雜 體系中高效地分離，并且被標記有標識物的抗體所識別定量檢測。
[0005] 本發明第一方面提供一種微流控芯片，包括：
[0006] 加樣室、Y型結構通道和回收室；
[0007] Y型結構通道分為上部的漏斗狀通道和下部的柱形通道；所述漏斗狀通道的底部 為免疫標記模塊；免疫標記模塊上部為濾血模塊；
[0008] 下部的柱形通道底端分岔為一對并行的免疫通道；每個免疫通道末端連接一個回 收室；
[0009] 柱形通道設置上下兩個腔室，上部腔室為強磁室，下部腔室為質控室。
[0010] 優選的，所述濾血模塊為玻纖或無紡布材料。
[0011] 優選的，所述濾血模塊以兔抗人紅細胞蛋白與凝集素按質量比2:1處理，凍干制 得。
[0012] 優選的，所述濾血模塊中間部位還包括結合抗體的免疫磁珠，所述免疫磁珠經過 活化劑活化。
[0013] 優選的，所述微流控芯片強磁室處的底部嵌有強磁片。
[0014] 本發明第二方面提供一種捕獲心肌標志物的方法，所述方法應用于上述任一實施 例所述的微流控芯片，所述方法包括：
[0015] 制作包被有能與血液中心肌標志物特異性結合的抗體的免疫磁珠；
[0016] 對所述心肌標志物的對位抗體標記免疫標識物；
[0017] 將包被抗體的免疫磁珠輸入所述芯片的濾血模塊，將標記對位抗體的免疫標識物 輸入免疫標記模塊；
[0018] 將一定量心肌標記物樣本與平衡液的混合液加至加樣室；
[0019] 啟動檢測設備，反應預設時間，對預定檢測項目結果進行檢測。
[0020] 優選的，不同的心肌標志物具有不同的磁珠包被體系。
[0021] 優選的，不同的心肌標志物具有不同的標識物；
[0022] 所述標識物包括：量子點、焚光微球和膠體金。
[0023] 優選的，所述心肌標志物包括：心肌肌鈣蛋白cTnl、肌紅蛋白MY0、C反應蛋白CRP、 心臟型脂肪酸結合蛋白FABP、N端腦鈉肽前體NT-proBNP、髓過氧化物酶ΜΡ0。
[0024] 優選的，所述心肌標志物為心肌肌鈣蛋白cTnl時，包被抗體的免疫磁珠的制備包 括：
[0025] 免疫磁珠平衡MES緩沖液至所述MES緩沖液的pH為4~5,離子強度為0. 1M;
[0026] 在平衡PH后的溶液中，分別加入EDC和NHS，至EDC與NHS在溶液中的濃度均為 lmg/mL，反應20分鐘后離心棄上清；
[0027] 以所述平衡前的MES緩沖液復溶棄上清后的沉淀物；
[0028] 復溶得到的溶液中加入抗體8E10至所述抗體8E10的濃度為0. 5mg/mL;
[0029] 混合包被1小時，加入BSA至所述BSA的濃度為1 %終止反應。
[0030] 優選的，所述心肌標志物為心肌肌鈣蛋白cTnl時，所述心肌標志物標記免疫標識 物包括：
[0031] lmg量子點平衡pH為7. 5~8. 5、濃度0. 01M的PBS緩沖液至所述量子點的濃度 為 0·lmg/mL;
[0032] 在平衡后的溶液中，分別加入EDC與NHS，至所述EDC和NHS的濃度均為0. 5mg/mL， 活化30分鐘后離心棄上清；
[0033] 以所述平衡前的PBS緩沖液復溶棄上清后的沉淀物；
[0034] 在復溶后的溶液中，加入抗體7G2，標記20分鐘，加入BSA至所述BSA的濃度為1 % 終止反應。
[0035] 優選的，所述心肌標志物為肌紅蛋白ΜΥ0時，包被抗體的免疫磁珠的制備包括：
[0036] 免疫磁珠平衡PB緩沖液至緩沖液的pH為7~8,離子強度為0. 1M;
[0037] 在平衡后的溶液中分別加入EDC與NHS，至所述EDC與NHS的濃度均為lmg/mL，反 應20分鐘后離心棄上清；
[0038] 以所述平衡前的PB緩沖液復溶棄上清后沉淀物；
[0039] 在復溶得到的溶液中，加入抗體4E2至所述抗體4E2的濃度為0. 5mg/mL，混合包被 1小時，加入BSA至所述BSA的濃度為1 %終止反應。
[0040] 優選的，所述心肌標志物為肌紅蛋白ΜΥ0時，所述心肌標志物標記免疫標識物包 括：
[0041] lmg熒光微球平衡pH為7~9、濃度0. 01M的PBS緩沖液至熒光微球的濃度為 0.lmg/mL；
[0042] 在平衡后的溶液中分別加入EDC與NHS，至所述EDC與NHS的濃度均為0. 5mg/mL， 活化30分鐘后離心棄上清；
[0043] 以所述平衡前的PBS緩沖液復溶棄上清后的沉淀物；
[0044] 在復溶后的溶液中，加入抗體ΜΥ0,標記20分鐘，加入BSA至所述BSA的濃度為1 % 終止反應。
[0045] 優選的，所述心肌標志物為C反應蛋白CRP時，包被抗體的免疫磁珠的制備包括：
[0046] 免疫磁珠平衡MES緩沖液至pH為4. 5~5. 5,離子強度為0. 1M;
[0047] 在平衡后的溶液中分別加入EDC與NHS，至所述EDC與NHS的濃度均為lmg/mL，反 應20分鐘后離心棄上清；
[0048] 以所述平衡前的MES緩沖液復溶棄上清后的沉淀物，加入抗體CRP135至所述抗體 CRP135在復溶后的溶液中的濃度為0. 5mg/mL;
[0049] 混合包被1小時，加入BSA至所述BSA在復溶后的溶液中的濃度為1 %終止反應。
[0050] 優選的，所述心肌標志物為C反應蛋白CRP時，所述心肌標志物標記免疫標識物包 括：
[0051 ] 40nm膠體金溶液以1(20)3溶液平衡至膠體金溶液pH為8. 5-9. 5 ;
[0052] 在平衡后的溶液中加入抗體CRP36,標記1小時；
[0053] 標記1小時后，在溶液中加入BSA至所述BSA的濃度為1 %終止反應；
[0054] 終止反應后離心，以離子強度為0. 1M、pH為7~9的PBS緩沖液復溶至終止反應 時溶液體積的〇. 1倍。
[0055] 優選的，所述標志物為心臟型脂肪酸結合蛋白FABP時，包被抗體的免疫磁珠的制 備包括：
[0056] 免疫磁珠平衡MES緩沖液至緩沖液pH為4~5，離子強度0. 1M;
[0057] 平衡后的溶液中分別加入EDC與NHS，至所述EDC和NHS的濃度均為lmg/mL，反應 20分鐘后離心棄上清；
[0058] 以所述平衡前的MES緩沖液復溶棄上清后的沉淀物，在復溶后的溶液中加入抗體 FABP5B5至濃度為1.Omg/mL，混合包被1小時，加入BSA至BSA濃度為1 %終止反應。
[0059] 優選的，所述標志物為心臟型脂肪酸結合蛋白FABP時，所述心肌標志物標記免疫 標識物包括：
[0060] lmg量子點平衡pH為7~8、濃度為0· 01M的PBS溶液至量子點濃度為0·lmg/mL;
[0061] 在平衡后的溶液中分別加入EDC與NHS，至EDC與NHS在溶液中的濃度均為0. 5mg/ mL，活化30分鐘后，離心棄上清；
[0062] 將棄上清之后的沉淀物以所述平衡前的PBS溶液復溶，加入抗體FABP28標記20 分鐘；
[0063] 加入BSA至所述BSA濃度為1 %終止反應。
[0064] 優選的，所述心肌標志物為N端腦鈉肽前體NT-proBNP時，包被抗體的免疫磁珠的 制備包括：
[0065] 免疫磁珠平衡PBS緩沖液至緩沖液的pH為6~7,離子強度為0. 01M;
[0066] 在平衡后的溶液中分別加入EDC與NHS，至所述EDC與NHS在溶液中的濃度均為 lmg/mL，反應20分鐘后離心棄上清；
[0067] 以所述平衡前的PBS緩沖液復溶棄上清后的沉淀物，加入抗體18H5至所述抗體 18H5在復溶后的溶液中的濃度為lmg/mL;
[0068] 混合包被1小時，加入BSA至所述BSA復溶后的溶液中的濃度為1 %終止反應。
[0069] 優選的，所述心肌標志物為N端腦鈉肽前體NT-proBNP時，所述心肌標志物標記免 疫標識物包括：
[0070]lmg量子點平衡pH為7. 5-8. 5、濃度為0·01M的PBS緩沖液至量子點的濃度0·lmg/ mL；
[0071] 在平衡后的溶液中分別加入EDC與NHS，至所述EDC和NHS的濃度分別為0.5mg/ mL，活化30分鐘后離心棄上清；
[0072] 以所述平衡前的PBS緩沖液復溶棄上清之后的沉淀物，加入抗體15F11，標記30分 鐘，加入BSA至所述BSA在復溶后的溶液中的濃度為1 %終止反應。
[0073] 優選的，所述心肌標志物為髓過氧化物酶ΜΡ0時，包被抗體的免疫磁珠的制備包 括：
[0074] 免疫磁珠平衡PB緩沖液至溶液pH為7. 5~8. 5,離子強度0· 01M;
[0075] 在平衡后的溶液中分別加入EDC與NHS，至EDC與NHS在溶液中的濃度均為lmg/ mL，反應20分鐘后離心棄上清；
[0076] 以所述平衡前的PB緩沖液復溶棄上清后的沉淀物，在復溶后的溶