乳粉中低聚半乳糖的高效液相色譜串聯質譜檢測方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及乳粉中低聚半乳糖的定量檢測，尤其涉及乳粉中低聚半乳糖的高效液 相色譜串聯質譜檢測方法。
【背景技術】
[0002] 棉籽糖、水蘇糖、毛蕊花糖是α-1，6糖苷鍵連接的低聚半乳糖 (Galactooligosaccharides，G0S)，由于它們富含于大豆中，也常被稱為大豆低聚糖。棉籽 糖的分子結構是蔗糖靠近葡萄糖一側以α-1，6糖苷鍵連接一個半乳糖，屬于三糖；水蘇糖 是棉籽糖靠近半乳糖一側以α-1，6糖苷鍵連接一個半乳糖，屬于四糖；而毛蕊花糖則是在 水蘇糖末端半乳糖再以α-1，6糖苷鍵連接一個半乳糖，屬于五糖。
[0003] 棉籽糖、水蘇糖、毛蕊花糖具有促進腸道有益菌生長，促進消化吸收，改善脂質代 謝，降低血脂和膽固醇，促進鈣和鎂等礦物元素的吸收，提高免疫力等生理功能，因此常被 添加到各類功能性食品中。尤其是在嬰幼兒乳粉中，往往人為添加低聚半乳糖，以模擬人乳 中含有低聚半乳糖的狀態，起到促進嬰幼兒的消化吸收的作用。棉籽糖、水蘇糖、毛蕊花糖 是低聚半乳糖的重要組成品種。目前國內并沒有完善成熟的乳粉中棉籽糖、水蘇糖、毛蕊花 糖的檢測標準，這使得相關指標的監管缺失，不利于保障乳制品的質量安全。因此，開發乳 粉中棉籽糖、水蘇糖、毛蕊花糖的檢測方法，具有重要的意義。
[0004] 利用高效液相色譜配示差檢測器或蒸發光散射檢測器檢測棉籽糖、水蘇糖、毛蕊 花糖已有一些文獻報道。如目前國內已發布的國家標準GB/T22491-2008《大豆低聚糖》， 標準中涉及了棉籽糖和水蘇糖的檢測方法。但現有方法存在如下缺陷：高效液相色譜檢測 方法的檢出限一般在lmg/kg的數量級，示差檢測器或蒸發光散射檢測器不能對棉籽糖、水 蘇糖、毛蕊花糖進行準確定性，因此容易因為雜質干擾造成誤差、誤判；另外由于乳粉樣品 成分復雜，檢測之前需要對樣品進行預處理，乳粉樣品的預處理方法嚴重影響檢測結果的 準確性，目前乳粉樣品的預處理方法檢測效果差。
【發明內容】
[0005] 鑒于現有技術的不足，本發明的目的是提供一種可以準確定性各種低聚半乳糖、 檢測結果更準確、檢出限更低的乳粉中低聚半乳糖的高效液相色譜串聯質譜檢測方法。
[0006] 本發明的目的可通過如下技術方案實現：
[0007] 乳粉中低聚半乳糖的高效液相色譜串聯質譜檢測方法，包括以下步驟：
[0008] (1)制備標準溶液并進行高效液相色譜串聯質譜檢測
[0009] 稱取各種低聚半乳糖標準品并將其配成混合標準儲備液；再將混合標準儲備液用 蒸餾水逐級稀釋，分別配成至少5種不同濃度的混合標準溶液，將不同濃度的混合標準溶 液進行高效液相色譜串聯質譜檢測并得到標準譜圖，標準譜圖中保留時間確定低聚半乳糖 品種，色譜峰面積與對應的低聚半乳糖濃度成函數關系；
[0010] (2)將步驟（1)獲得的標準譜圖按低聚半乳糖品種分別制作濃度與色譜峰面積關 系曲線圖；
[0011] (3)乳粉樣品進行預處理及高效液相色譜串聯質譜檢測；
[0012] 稱取乳粉樣品，加入蒸餾水和無水乙醇溶解，渦旋振蕩后，超聲溶解，離心，取上清 液稀釋后過濾膜過濾，取濾液進行高效液相色譜串聯質譜檢測，得乳粉樣品譜圖；
[0013] (4)樣品中的低聚半乳糖的含量的確定
[0014] 將步驟（3)獲得的樣品譜圖的保留時間確定低聚半乳糖品種并將其色譜峰面積 代入步驟（2)對應的低聚半乳糖品種的標準曲線方程，計算樣品中各種低聚半乳糖的含 量。
[0015] 優選的，在步驟⑴中的不同濃度的混合標準溶液濃度從50μ8·?/至 1500μg·L1分為6級，級間間隔由小至大大致倍增，每濃度級中各低聚半乳糖標準品含量 相同。
[0016] 優選的，在步驟（3)中，所述蒸餾水與無水乙醇的體積比可為3:2。
[0017]優選的，在步驟（3)中，樣品的前處理的具體步驟如下：稱取乳粉樣品，加入體積 比為3:2的蒸餾水和無水乙醇溶解，渦旋振蕩后，超聲溶解，在10°C下，以8000r·min1離 心5min，取上清液稀釋后采用0. 22μm水相濾膜過濾。
[0018] 在步驟⑴和⑶中，高效液相色譜串聯質譜的實驗條件如下：
[0019] 色譜條件：
[0020] ①色譜柱選用XBridgeTMAmide，3. 5μm，4· 6X150mm，進樣量為 5μL，柱溫為 40°C，流速為 0· 4mL·minS
[0021] ②流動相和洗脫程序如下：
[0022] 流動相A:40/60乙腈/水（混合溶液含0· 10 %氨水）；
[0023] 流動相B:70/30乙腈/水（混合溶液含0· 10%氨水）；
[0024] 0~30min，流動相A從0到40 %，流動相B從100 %到60 %;
[0025] 30~33min，流動相A從40 %到60 %，流動相B從60 %到40 %;
[0026] 33~35min，流動相A保持60 %，流動相B保持40 %;
[0027] 35~37min，流動相A從60%到0,流動相B從40%到100%。
[0028]質譜條件：離子化方式為電噴霧電離；掃描方式為負離子掃描；檢測方式為多反 應監測（MRM)。
[0029] 與現有技術對比，本發明具有如下突出的實質性特點和顯著進步：
[0030] 本發明采用高效液相色譜串聯質譜法檢測乳粉中低聚半乳糖，不僅靈敏度高，而 且選擇性和特異性好，不僅可對乳粉中含有的低聚半乳糖進行定性確認，克服樣品基質干 擾，而且能夠有效排除假陽性，進行乳粉中各種低聚半乳糖的定量分析。本發明首次提供 有效，可靠的乳粉樣品預處理方法，處理操作簡單、準確度好、精度高。本發明對乳粉中棉籽 糖、水蘇糖、毛蕊花糖的檢測的檢出限可以顯著提高到〇. 〇lmg·kg1的數量級。此外，由于 二級質譜通過同時掃描待測化合物母離子分子離子峰和子離子分子離子峰的方式，達到針 對棉籽糖、水蘇糖、毛蕊花糖準確定性的效果。因此利用高效液相色譜串聯質譜法對乳粉中 棉籽糖、水蘇糖、毛蕊花糖的檢測將有效地克服現有標準和文獻方法的缺點。
【附圖說明】
[0031] 圖1為1國產學生奶粉的高效液相色譜質譜圖：1-棉籽糖，2-水蘇糖，3-毛蕊花 糖。
[0032] 圖2為濃度為lOOOmg·L1的低聚半乳糖混合標準溶液的高效液相色譜串聯質譜 圖：1-棉籽糖，2-水蘇糖，3-毛蕊花糖。
[0033] 圖3為棉籽糖的濃度與色譜峰面積關系標準曲線圖。
[0034] 圖4為水蘇糖的濃度與色譜峰面積關系標準曲線圖。
[0035] 圖5為毛蕊花糖的濃度與色譜峰面積關系標準曲線圖。
【具體實施方式】
[0036] 下面通過實例對本發明做進一步的描述，這些描述并不是對本
【發明內容】
進一步的 限定。本領域的技術人員應理解，對本
【發明內容】
所做的等同替換或相應的改進，仍屬于本發 明的保護范圍之內。
[0037] 乳粉中低聚半乳糖的高效液相色譜串聯質譜檢測方法，包括以下步驟：
[0038] (1)制備標準溶液并進行高效液相色譜串聯質譜檢測
[0039] 分別準確稱取棉籽糖、水蘇糖標準品各0.lg(精確到0.OOOlg)于10mL容量瓶，用 超純水溶解并定容，配制成濃度為l〇〇〇mg噸1于4°C冰箱中保存，毛蕊花糖標準品0. 5g(精 確到0.OOOlg)于10mL容量瓶，用超純水溶解并定容，配制成濃度為500mg*L1于4°C冰箱中 保存；將配制好的各單標標準液混合并用超純水配成濃度：（50、100、200、500、1000、1500) μg·L1的混合標準溶液，于4°C冰箱中保存，待測。
[0040] 將不同濃度的混合標準溶液進行高效液相色譜串聯質譜檢測并得到標準圖譜， 即分別得到低聚半乳糖標準品濃度為50μg·L\ 100μg·LUooμg·L^500μg·L\ 1000μg*L1和1500μg*L1的混合標準溶液的保留時間與響應值之間