一種金納米粒子探針比色法檢測久效磷殘留的方法
【技術領域】
[0001] 本發明屬于分析檢測技術領域，具體涉及一種金納米粒子探針比色法檢測久效磷 殘留的方法。
【背景技術】
[0002] 農藥殘留嚴重威脅著人類的生存環境和生命安全。因此，農藥殘留檢測技術的開 發一直是研究的熱點。農藥殘留中以有機磷類農藥污染最為嚴重，基于有機磷農藥對乙酰 膽堿酯酶（AChE)的抑制作用而發展的乙酰膽堿酯酶生物傳感器已被廣泛用于有機磷類農 藥的檢測。但是此類方法往往存在著酶穩定性差，操作繁瑣費時且成本較高的缺陷。將功 能化的納米材料引入食品質量安全檢測的相關領域是目前研究的熱點。金納米粒子由于具 有優良的光學性能而被用作比色探針，其溶液顏色與粒徑及顆粒間距有關。當顆粒間距明 顯小于粒徑，金納米顆粒就容易發生團聚，宏觀上溶液顏色由紅色變為紫色或藍色，利用這 一性質，在控制金納米粒子粒徑的同時，結合各種表面改性方法就可以設計出多種多樣的 金納米比色探針。基于乙酰膽堿酯酶活性抑制原理，以農藥久效磷為模型，創新性的采用金 納米粒子作為比色探針，檢測有機磷農藥的殘留，旨在構建出一套快速高效的農藥殘留檢 測新方法。
[0003]目前，隨著納米技術發展，人們更加注重為實現以最高限度利用納米技術的優勢 和最低限度降低其對人類和環境破壞，追求綠色納米科技為目標。本發明制備的金納米粒 子方法綠色環保，采用橘皮為制備原料，既是廢物利用，又可降低生產成本，原料充足易獲 得。在離子溶液中制備納米材料是一種常用方法，雖然部分有機溶劑作為還原劑或穩定劑 在反應中被消耗，但其中仍有一些被浪費，這樣就污染環境，很難達到零排放的目的。本方 法采用水作為溶劑制備金納米粒子，對環境和人類無毒無害。
【發明內容】
[0004] 本發明所要解決的技術問題在于克服上述檢測的缺點，構建出一套快速高效的久 效磷殘留的檢測新方法。
[0005] 解決上述技術問題所采用的技術方案由下述步驟組成： (1)制備金鈉米粒子 將新鮮柑橘成熟果實的外皮烘干后粉碎，過40目篩，浸泡于去離子水中，橘子皮與去 離子水質量比為1:10,浸泡1-2小時，再將浸泡液于4000rpm條件下，離心3分鐘，取上清 液，此上清液作為浸泡液母液。采用去離子水將浸泡液母液稀釋1倍獲得所需工作液，冰箱 4°C條件下保存。
[0006] 室溫條件下，將4°C、濃度為lg/mL的氯金酸溶液置于反應皿中，伴隨磁力攪拌器 溫和攪動100-150rpm;2分鐘后，迅速將上述工作液加入氯金酸溶液中，氯金酸溶液與工 作液的體積比為3:1-6:1即觀察顏色的變化，即由黃色變為紫色再變為淺酒紅色，當體系 顏色出現酒紅色時，攪拌速度提升到300-350rpm，10分鐘后結束反應，獲得金納米粒子溶 液，金納米粒子溶液顏色為淺酒紅色，置于冰箱4°C保存備用。
[0007] (2)測定金鈉米粒子的紫外吸收光譜 吸取步驟（1)所制備的金納米粒子溶液，加入到比色皿中，再加入去離子水，金納米粒 子溶液與蒸餾水體積比為1:2,混合均勻后，置于紫外-可見光分光光度計中測定吸光度， 測得結果金納米粒子吸收峰在520-550nm。
[0008] (3)比色探針法檢測久效磷殘留 ①底物的預處理： 首先選擇碘化硫代乙酰膽堿(ATChl)作為反應底物，采用去離子水配置10mM的ATChl溶液100mL。向5ml的ATChl溶液中加入18mg硝酸銀粉末，充分振蕩10秒鐘，豎直靜置 1分鐘后離心去沉淀，取上清液。再向上清液中加入1mg氯化鈉，充分振蕩10秒鐘，豎直 靜置1分鐘后離心去沉淀，取上清液。此時上清液為含有ATCh+溶液。
[0009] ②金納米粒子比色法的建立： 分別向離心管中加入無菌水，久效磷工作液和乙酰膽堿酯酶緩沖液后等待10分鐘，再 加入ATCh+溶液，等待10分鐘后，加入金納米粒子溶液，記錄顏色變化，伴隨著久效磷濃度 的提高，顏色逐漸由淺酒紅色轉變至紫色再變為深藍色。
[0010] 在本發明在檢測久效磷殘留的步驟中，用無菌水配制的久效磷工作液濃度為 0. 01mg/mL;用濃度為0.lmol/L的磷酸緩沖液配制濃度為2U/mL的乙酰膽堿酯酶緩沖液； 0·lmol/L磷酸緩沖液的配制：100mL的磷酸緩沖液需0·lmol/LΚ2ΗΡ04水溶液80. 2mL和 0·lmol/LΚΗ2Ρ04的水溶液 19. 8mL。
[0011] 金納米粒子比色法的建立：無菌水、久效磷工作液、乙酰膽堿酯酶緩沖液、ATCh+溶 液、金納米粒子溶液的體積比為5 :10 :1 :1 :4。
[0012] 制備后金納米粒子在6天內具備穩定性，能夠正常使用。
[0013] 金納米粒子探針比色法檢測久效磷最低濃度為0. 00005mg/mL。
[0014] 乙酰膽堿酯酶能夠特異性的催化底物碘化硫代乙酰膽堿(ATChl)水解為硫代乙 酰膽堿與醋酸。當體系中特異性的去掉碘離子之后(碘離子能夠與久效磷結合干擾檢測體 系)，底物表面豐富的正電荷能夠引起表面帶有負電荷的金納米粒子的聚集，出現等離子體 共振現象，從而引起整個體系顏色的變化。然而，當體系中存在有久效磷的時候，乙酰膽堿 酯酶的活性受到抑制而無法催化底物的水解反應，隨之，底物會與金納米粒子結合進入提 高了金納米粒子的聚集程度。久效磷濃度的不同，使得乙酰膽堿酯酶受抑制的程度不同，最 終體系的顏色也就不同，根據此原理構建以金納米粒子比色探針為依托的久效磷殘留快速 檢測體系。
[0015] 有益效果 本發明制備金納米粒子方法綠色環保，采用橘皮為制備原料，既是廢物利用，又可降低 生產成本，原料充足易獲得。本發明檢測久效磷殘留方法穩定、靈敏度高、選擇性好。
【附圖說明】
[0016] 圖1是采用實施例1檢測不同濃度久效磷的直觀圖。
[0017] 圖2是采用實施例1檢測不同濃度久效磷的紫外吸收變化線性曲線圖。
[0018] 圖3是用透射電子顯微鏡表征不同濃度久效磷比色檢測的體系中金納米粒子的 聚集程度。
[0019] 圖4是金納米粒子檢測久效磷的選擇性研究。
[0020] 圖5是金納米粒子的穩定性研究。
【具體實施方式】
[0021] 下面結合附圖和實施例對本發明進一步詳細說明，但本發明不限于這些實施例。
[0022] 實施例1 本實施的金納米粒子探針比色法檢測久效磷殘留的方法由下述步驟組成： 1.制備金鈉米粒子 將100g新鮮柑橘成熟果實的外皮烘干后粉碎，過40目篩，浸泡于去離子水中，橘子皮 與去離子水質量比為1 :1〇,浸泡1小時，再將浸泡液于4000rpm條件下，離心3分鐘，取上 清液，此上清液作為浸泡液母液。采用去離子水將浸泡液母液稀釋1倍獲得所需工作液，冰 箱4°C條件下保存。
[0023] 室溫條件下，將4°C、濃度為lg/mL的氯金酸溶液置于反應皿中，伴隨磁力攪拌器 溫和攪動lOOrpm;2分鐘后，迅速將上述工作液加入氯金酸溶液中，氯金酸溶液與工作液 的體積比為4:1，隨即觀察顏色的變化，即由黃色變為紫色再變為淺酒紅色，當體系顏色出 現酒紅色時，攪拌速度提升到300rpm，10分鐘后結束反應，獲得金納米粒子溶液，金納米粒 子溶液顏色為淺酒紅色，置于冰箱4°C保存備用。
[0024] 2.測定金鈉米粒子的紫外吸收光譜 吸取步驟（1)所制備的金納米粒子溶液，加入到比色皿中，再加入去離子水，金納米粒 子溶液與蒸餾水體積比為1:2,混合均勻后，置于紫外-可見光分光光度計中測定吸光度， 測得結果金納米粒子吸收峰在530nm。
[0025] 3.比色探針法檢測久效磷殘留 底物的預處理： 首先選擇碘化硫代乙酰膽堿(ATChl)作為反應底物，采用去離子水配置10mM的ATChl溶液100mL。向5ml的ATChl溶液中加入18mg硝酸銀粉末，充分振蕩10秒鐘，豎直靜置 1分鐘后離心去沉淀，取上清液。再向上清液中加入1mg氯化鈉，充分振蕩10秒鐘，豎直 靜置1分鐘后離心去沉淀，取上清液。此時上清液為含有ATCh+的溶液。
[0026] 金納米粒子比色法的建立： 用無菌水配制的久效磷工作液濃度為0. 01mg/mL，用濃度為0. lmol/L的磷酸緩沖液配 制濃度為2 U/mL的乙酰膽堿酯酶緩沖液；0. lmol/L磷酸緩沖液的配制：100mL的磷酸緩沖 液需 〇· lmol/L Κ2ΗΡ04水溶液80. 2mL和0· lmol/L腿丨04的水溶液19. 8mL。
[0027] 向離心管中分別加入2. 5mL的無菌水，5mL無菌水(空白對照)及5ml不同濃度 的久效磷溶液（〇· 〇〇〇〇1、〇· 00005、0· 0001、0· 00025、0· 0005、0· 001、0· 0025、0· 005 和 0· 01 mg/mL)和0. 5mL乙酰膽堿酯酶緩沖液（2U/mL)充分反應10分鐘后，再加入0. 5mLATCh+ 溶液，待10分鐘后，加入2mL金納米粒子溶液，后記錄各個濃度反應液顏色變化。采用紫 外-可見光分光光度計掃描不同比色體系的吸收光譜的變化。
[0028]從左至右依次為：含久效磷濃度 0· 01、0· 005、0· 0025、0· 001、0· 0005、0· 00025、 0· 0001、0· 00005、0· 00001mg/mL·、空白對照（5ml無菌水）。
[0029] 由圖1可知，伴隨著農藥濃度的提高，顏色逐漸由酒紅色轉變至紫色再變為深藍 色，說明體系中乙酰膽堿酯酶的活性逐漸受到抑制，底物的含量逐漸增高造成了金納米粒 子的粒徑逐漸增大，出現不同程度的聚集。在久效磷農藥濃度為0. 01mg/mL的比色體系中， 金納米粒子甚至出現了沉淀。在久效磷農藥濃度為0.00001mg/mL的比色體系中，整體顏 色與對照幾乎沒有差異。當久效磷農藥濃度為0.00005mg/mL時，體系顏色開始出現淡紫 色，呈現出鮮明的比色結果。
[0030]采用紫外-可見光吸收光譜表征不同濃度久效磷的比色檢測結果，進一步論證金 納米粒子粒徑的變化過程。由圖2可知，紫外-可見光吸收光譜基本呈現出與直觀比色相似 的結果。當久效磷的濃度逐漸增加時，波長530nm處金納米粒子特征峰的峰值開始下降； 與此同時，在波長650-780nm的范圍內出現新的吸收峰。結果說明，不同濃度的久效磷可 以引起不同程度的金納米粒子的聚集，形成不同粒徑大小的金納米粒子，進而造成金納米 粒子特征吸收峰的波長不同。其中，在久效磷農藥濃度為0.00001mg/mL的體系的吸收峰 的峰值相比于對照的峰值出現明顯的下降，但是在比色體系中顏色變化并不明顯。
[0031]采用透射電子顯微鏡進一步表征不同濃度久效磷比色檢測的體系（挑選三個體 系，分別含久效磷濃度為〇. 0000U0. 001和〇. 01mg/mL)中金納米粒子的聚集過程，結果見 圖3可知，A:含久效磷濃度0. 00001mg/mL;B:含久效磷濃度0. 001mg/mL;C含久效磷濃度 0. 01