痕量微生物快速檢測方法
【技術領域】
[0001]本發明屬于微生物檢測領域，尤其涉及一種痕量微生物的快速檢測方法。
【背景技術】
[0002]隨著社會的快速發展，在工業生產、制藥制水、食品藥品監測等領域中，都亟需實現對痕量細菌的快速實時檢測，從而保證工業生產電子元器件的質量，藥品、水質及食品的質量安全。
[0003]當前對細菌的檢測方法主要有經典的平板培養計數法、顯微熒光計數法和當前熱門的流式細胞術。
[0004]平板計數法計數準確，可靠度高，成本低，但因需進行細菌培養，檢測速度慢，時間可長達48?72小時，不能滿足特定場合的快速、實時性要求，同時，有些細菌的培養條件苛刻，當生長環境，如溫度、營養物組成發生改變時，一些細菌會進入一種“活的不可培養”狀態，導致計數結果不準確。
[0005]顯微熒光計數法是先對目標物品進行染色處理后，置于熒光顯微鏡中進行觀測，手動計數的方法。該方法檢測時間較長，觀測中存在較明顯的離焦情況，一次所能觀測的區域也較小，且手動計數存在很多不確定性，計數結果準確度不高。
[0006]流式細胞術是利用將標本預處理后，制成單細胞懸浮液，再進行具有特異性的、化學定量關系的染色后，懸浮液進入流動室，通過用激光激發，測定散射光和熒光，實現細菌形態及各種成分的檢測。流式細胞術具有速度快，多參數檢測的優點，但要求被測物濃度在幾百到幾千數量級，對于痕量微生物計數檢測誤差很大。
[0007]綜上所述，目前雖然已有很多微生物檢測方法與技術，但其中大多數方法的檢測速度或檢測精度上有很大不足，應用范圍相當局限，尚不能實現痕量微生物的快速、多參數精確檢測。
【發明內容】
[0008]針對現有技術微生物檢測中存在的不足之處，本發明提供一種痕量微生物快速檢測方法，該方法實現了對痕量微生物的快速實時檢測。
[0009]為了解決上述技術問題，本發明提出的一種痕量微生物快速檢測方法，包括以下步驟:
[0010]步驟一、采用粒徑為小于0.Ιμπι的熒光染料對目標微生物進行熒光標記；
[0011 ]步驟二、用孔徑為0.2?Ιμπι，且為無自發熒光的濾膜和換膜過濾器對樣本溶液進行過濾，從而將目標微生物截留于所述濾膜上；
[0012]步驟三、由中央控制單元同步進行熒光信號的采集和對濾膜的激光掃描，從而獲得濾膜的目標微生物分布的二維圖像和目標微生物的計數結果;過程如下:
[0013]準直激光束經二維掃描振鏡反射后進入掃描透鏡，經由二維掃描透鏡在被測濾膜上表面聚焦，發濾膜上的目標微生物吸收激光能量，通過能級躍迀，釋放出熒光信號，該熒光信號由掃描透鏡收集，之后投射到二維掃描振鏡上，經二維掃描透鏡反射后沿激光束入射反方向傳播，然后依次通過二向分色鏡、熒光濾光鏡、聚焦透鏡和共焦孔，進入光電探測器轉換為模擬電信號，模擬電信號由數據采集卡轉換為數字信號，并最終輸出到中央控制單元，完成單點熒光信號采集;在中央控制單元控制下同步驅動振鏡進行二維激光束掃描和熒光信號采集，完成對濾膜表面一個矩形區域的檢測，獲得的信號為一維信號；之后，對采集到的一維信號進行濾波、特征峰值提取、計數和二維圖像重構處理，從而生成顯示目標微生物分布狀態的二維圖像，并輸出目標微生物的計數結果。
[0014]其中，步驟三中，對濾膜的激光掃描是利用激光掃描系統對步驟二獲得的截留有微生物的濾膜進行激光掃描，所述激光掃描系統的光學景深大于1 Ομπι?200μηι，優選30?ΙΟΟμπι。所述激光掃描系統的波長根據步驟一所用的熒光染料特性決定，激光波長為所選用熒光染料的峰值吸收波長，所述激光掃描系統的功率設計為1?200mw，優選10?50mw
[0015]與現有技術相比，本發明的有益效果是:
[0016](1)通用性好:可以實現對大多數微生物的檢測，而可以檢測區分死活細菌，具有良好的通用性。
[0017](2)速度快:由于檢測不需要進行培養，并且掃描的速度也非常快，因此，總體檢測的速度很快，完成單個樣本的檢測時間在15分鐘內(包括樣本前期準備時間)。
[0018](3)痕量檢測:檢測下限低，可以檢測細菌的范圍從1?50000，尤其對細菌數量在100以下的樣本液仍可以完成快速、準確檢測。
【附圖說明】
[0019]圖1為本發明痕量微生物快速檢測方法的流程示意圖；
[0020]圖2為本發明痕量微生物快速檢測方法實施步驟的流程示意圖；
[0021 ]圖3為本發明痕量微生物快速檢測方法濾膜熒光檢測流程示意圖；
[0022]圖4為本發明實施例提供的檢測細菌液所得圖片。
【具體實施方式】
[0023]下面結合附圖和具體實施例對本發明技術方案作進一步詳細描述，所描述的具體實施例僅對本發明進行解釋說明，并不用以限制本發明。
[0024]本發明一種痕量微生物快速檢測方法，其中，需要用到的器件通常包括中央控制單元、數據采集卡、光電探測器、激光器、二向分色鏡、熒光濾光鏡、聚焦透鏡、二維掃描振鏡、掃描透鏡、濾膜和共焦孔，如圖3所示;該檢測方法包括以下步驟:
[0025]步驟一、熒光標記:采用粒徑小于0.Ιμπι的熒光染料對目標微生物進行熒光標記，所述熒光標記通過選取特定波長激發的熒光標記物，對微生物特定組分進行標記，熒光標記物與微生物特定組分結合后，在激光激發下，量子產率得到極大提高，熒光強度會得到極大增強；
[0026]步驟二、溶液過濾:選取孔徑為0.2?Ιμπι、且為無自發熒光的濾膜和換膜過濾器對樣本溶液進行過濾，濾膜自身無熒光效應，通過濾膜對水溶液過濾，實現目標微生物與水的分離，由于熒光染料(粒徑為小于0.Ιμπι)自身不會被濾膜截留，因此，把目標微生物截留于所述濾膜上面；
[0027]步驟三、樣本掃描:把過濾后的樣本置于雙振鏡掃描檢測系統平臺中，點亮激光器，特定激發波長激光通過光路后，對目標微生物進行熒光激發，在檢測系統中，通過設定大光束雙振鏡系統擺動的方式、速度，光斑隨雙振鏡系統擺動而移動進行掃描，可以實現對目標微生物的快速移動掃描。即由中央控制單元同步進行對濾膜的激光掃描和熒光信號的采集，從而獲得濾膜的目標微生物分布的二維圖像和目標微生物的計數結果;過程是:準直激光束經二維掃描振鏡反射后進入掃描透鏡，經由二維掃描透鏡在被測濾膜上表面聚焦，發濾膜上的目標微生物吸收激光能量，通過能級躍迀，釋放出熒光信號，該熒光信號由掃描透鏡收集，之后投射到二維掃描振鏡上，經二維掃描透鏡反射后沿激光束入射反方向傳播，然后依次通過二向分色鏡、熒光濾光鏡、聚焦透鏡和共焦孔，進入光電探測器轉換為模擬電信號，模擬電信號由數據采集卡轉換為數字信號，并最終輸出到中央控制單元，完成單點熒光信號采集;在中央控制單元控制下同步驅動振鏡進行二維激光束掃描和熒光信號采集，完成對濾膜表面一個矩形區域的檢測，獲得的信號為一維信號。之后，對采集到的一維信號進行濾波、特征峰值提取、計數和二維圖像重構處理，生成顯示目標微生物分布狀態的二維圖像，并輸出目標微生物