以熒光碳點為探針運用倍頻散射法檢測胰蛋白酶的方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種胰蛋白酶濃度的檢測方法。更具體地說，本發明涉及一種利用熒光碳點倍頻散射光檢測胰蛋白酶的方法。
【背景技術】
[0002]胰蛋白酶為蛋白酶的一種，作為消化酶而起作用。在胰臟是作為酶的前體胰蛋白酶原而被合成的。作為胰液的成分而分泌，受腸激酶，或胰蛋白酶的限制分解成為活化胰蛋白酶，是肽鏈內切酶，它能把多肽鏈中賴氨酸和精氨酸殘基中的羧基側切斷。它不僅起到消化酶的作用，而且還能限制分解糜蛋白酶原、羧肽酶原、磷脂酶原等其它酶的前體，起活化作用。是特異性最強的蛋白酶，在決定蛋白質的氨基酸排列中，它成為不可缺少的工具。
[0003]近年來，熒光碳點是繼富勒烯、碳納米管及石墨烯之后最熱門的碳納米材料之一。這種納米材料克服了傳統量子點的某些缺點，不僅具有優良的光學性能與小尺寸特性，而且具有良好的生物相容性，易于實現表面功能化，在生化傳感、成像分析、環境檢測、光催化技術及藥物載體等領域具有很好的應用潛力。但迄今為止，將熒光碳點熒光探針用于胰蛋白酶檢測的相關報道仍未見。
[0004]光散射現象廣泛存在于光與粒子的作用過程中，是指當光通過介質時在入射光方向以外的各個方向上所觀察到的光現象。它源于光電磁波的電場振動而導致的分子中電子產生的受迫振動所形成的偶極振子。根據電磁理論，振動著的偶極振子是一個二次波源，它向各個方向發射的電磁波就是散射波。光散射與介質的不均勻性有關，除了真空之外的其它所有介質都有一定程度的不均勻性，從而產生散射光。如今，光散射技術逐步發展成為一門新的分析技術。該技術具有簡便、快速，靈敏度高，儀器操作方便等優點。近年來已被成功應用于核酸、蛋白質、無機離子、免疫和藥物等的分析測定。但迄今為止，將熒光碳點作為探針，利用胰蛋白酶增強熒光碳點倍頻散射光強度的特性，用于檢測胰蛋白酶的相關報道仍未見。
【發明內容】
[0005]本發明的一個目的是解決至少上述問題和/或缺陷，并提供至少后面將說明的優點。
[0006]本發明還有一個目的是提供一種熒光碳點檢測胰蛋白酶的新方法，該方法操作簡單，檢測快速且靈敏度高，能進行溶液中胰蛋白酶的高靈敏識別，且檢出限低。
[0007]本發明還有一個目的是研究熒光碳點在胰蛋白酶濃度檢測中的新應用。
[0008]為了實現根據本發明的這些目的和其它優點，提供了一種以熒光碳點為探針運用倍頻散射法檢測胰蛋白酶的方法，包括:
[0009]在激發波長為690nm的條件下，對熒光碳點與胰蛋白酶的結合物進行激發，以產生倍頻散射光，檢測倍頻散射光的強度選擇最優的激發波長，將所述倍頻散射光的強度與相同檢測條件下建立的胰蛋白酶濃度的標準曲線進行比對，以獲得胰蛋白酶濃度。
[0010]優選的是，其中，胰蛋白酶濃度的標準曲線的建立方法具體為:
[0011]配制含熒光碳點的不同濃度的胰蛋白酶標準溶液，在激發波長為690nm的條件下，檢測標準溶液的倍頻散射光強度，建立標準溶液的倍頻散射光強度與胰蛋白酶濃度之間的線性關系，獲得胰蛋白酶濃度的標準曲線，用于檢測樣品溶液中胰蛋白酶濃度。
[0012]優選的是，其中，含熒光碳點的不同濃度的胰蛋白酶標準溶液的配制方法具體為:
[0013]取不同體積的胰蛋白酶原溶液，并向其中分別添加相同體積的熒光碳點及不同體積的緩沖溶液至混合液的體積相等，得到等體積含熒光碳點的不同濃度的胰蛋白酶標準溶液。
[0014]優選的是，其中，配制所述樣品溶液的方法為:
[0015]向未知胰蛋白酶溶液中加入一定體積的熒光碳點，使得與所述標準溶液中熒光碳點的體積相同，加入緩沖溶液至與所述標準溶液的體積相同，得到所述樣品溶液。
[0016]優選的是，其中，所述緩沖溶液為pH為6的磷酸鹽緩沖溶液。
[0017]優選的是，其中，所述標準溶液和所述樣品溶液中熒光碳點的濃度均為6.lmg/mL。
[0018]優選的是，其中，所述標準溶液與所述樣品溶液的體積均為3mL。
[0019]優選的是，其中，所述胰蛋白酶原液的濃度為3X104mol/L、3X105mol/L、3X10 6mol/L 或 3X 10 7mol/L。
[0020]優選的是，其中，所述熒光碳點的制備方法為:
[0021]步驟a、將1.0g分子量為1500的聚乙二醇和15ml甘油攪拌后置于微波反應器中，在140°C下高溫反應15min ；
[0022]步驟b、將步驟a得到的樣品冷卻到50°C后加入1.0g的絲氨酸，然后升溫至180°C微波反應lOmin ；
[0023]步驟c、將步驟b得到的樣品注入分子量1000的透析袋中透析24小時后進行蒸發濃縮，得到300ml的透析液；
[0024]步驟d、將所述300ml的透析液在60°C下旋轉蒸發一個小時，得到260ml樣品，所述樣品即為熒光碳點。
[0025]本發明至少包括以下有益效果:
[0026]1、本發明將熒光碳點作為探針，利用熒光碳點的倍頻散射光強度隨胰蛋白酶溶液的濃度的增加而增強的特性，對胰蛋白酶的濃度進行高靈敏檢測，該方法操作簡單、檢測快速、靈敏度高且選擇性好，可對混合樣品中胰蛋白酶進行在線原位快速靈敏檢測，檢出限可達到 7.8X10 10mol/Lo
[0027]2、本發明通過微波反應合成法制備的熒光碳點的細胞毒性低，反應條件溫和可控，且產率較高，且能夠與胰蛋白酶有效地進行特異性結合，生成一種結合物，該結合物能夠在一定波長的光的激發下進行躍迀，而產生倍頻散射光，通過檢測倍頻散射光的強度，進而得到胰蛋白酶的濃度。
[0028]本發明的其它優點、目標和特征將部分通過下面的說明體現，部分還將通過對本發明的研究和實踐而為本領域的技術人員所理解。
【附圖說明】
[0029]圖1為本發明的一個實施例中標準溶液的倍頻散射光譜圖；
[0030]圖2為本發明的一個實施例中胰蛋白酶濃度的標準曲線。
【具體實施方式】
[0031]下面結合附圖對本發明做進一步的詳細說明，以令本領域技術人員參照說明書文字能夠據以實施。
[0032]<實施例1>
[0033]一、焚光碳點的合成
[0034]將l.0g分子量為1500的聚乙二醇和15ml甘油攪拌后置于微波反應器中，在140°C下高溫反應15min，待試管冷卻到50°C后加入1.0g的絲氨酸，然后升溫至180°C微波反應lOmin，將制得的樣品注入分子量1000的透析袋中透析24小時后進行蒸發濃縮，得到300ml的透析液，將所述300ml的透析液在60°C下旋轉蒸發一個小時，得到260ml樣品，所述樣品即為熒光碳點。
[0035]二、建立胰蛋白酶濃度的標準曲線
[0036]1、配制含熒光碳點的不同濃度的胰蛋白酶標準溶液，具體為:
[0037]取不同體積的濃度為3X10 4mol/L的胰蛋白酶原溶液，并向其中分別添加相同體積的熒光碳點及不同體積的pH為6的磷酸鹽緩沖溶液至混合液的體積均為3mL，其中，熒光碳點的濃度為6.lmg/mL，得到等體積含熒光碳點的不同濃度的胰蛋白酶標準溶液，該標準溶液中胰蛋白酶的濃度分別為 0,1X10 9mol/L、7X 10 9mol/L、3X 10 smol/L、5X 10 smol/L、7X 10 smol/L、1 X 10 7mol/L，依次標記為 g、f、e、d、c、b、和 a。
[0038]2、檢測標準溶液的倍頻散射光強度并建立標準曲線，具體為:
[0039]將上述標準溶液靜置3分鐘后，在激發波長690nm的條件下，對標準溶液進行激發，從而產生倍頻散射光，檢測標準溶液的倍頻散射光強度，圖1為標準曲線的倍頻散射光譜圖，從倍頻散射光譜圖可得知熒光碳點的倍頻散射光信號強度隨胰