熱休克蛋白90(hsp90)化學發光檢測試劑盒的制作方法
【技術領域】
[0001] 本發明屬于臨床血液免疫檢測技術領域，具體的，本發明提供了一種熱休克蛋白 90 (HSP90)化學發光檢測試劑盒及其制備方法。本發明的試劑盒具有簡便、快速、靈敏、穩定 等優點。該試劑盒檢測的靈敏度高，特異性強。
【背景技術】
[0002] 休克蛋白化eat化ockProtein,服巧是1962年由遺傳學家Ritossa發現的，運 是一類在生物進化過程中高度保守并廣泛存在于原核及真核生物中的蛋白質。熱休克蛋白 是生物受到環境中的物理、化學、生物、精神等刺激時發生應激反應而合成的蛋白質，能夠 維持信號轉導蛋白的功能，在細胞突變過程中是一個重要的緩沖因子，調控著多種細胞生 理、生化變化過程中重要蛋白的空間結構和突變。根據分子質量大小不同，熱休克蛋白可分 為服P100、服P90、服P70、服P60和小服P五大家族。服P90的分子量約為83~90kda，含 有732個氨基酸，保守的N-末端約為25kda，由第1~235位氨基酸組成，鏈接區（linker region，LR)由第235~272氨基酸組成，中間區域（theMiddleDomain,Μ)由第272~629 氨基酸組成，5化da的C-末端由第629~732氨基酸組成。20世紀90年代初，Blachere等 [引證實，從腫瘤細胞中提取獲得的熱體克蛋白可W導致宿主產生很強的免疫反應，運可能 是由于運種熱體克蛋白可W作為一些腫瘤抗原的分子伴侶。服P90還參與腫瘤血管的生長、 侵襲及轉移。研究表明，腫瘤組織中服P90呈高表達狀態，通過免疫組化可觀察到服P90表 達與腫瘤的分化程度，淋己結的轉移有不同程度的相關。 近十幾年來標記免疫分析技術的研究和應用發展迅速，已廣泛應用于生物醫學基礎 理論研究及臨床疾病診斷各領域。其中技術工藝成熟，具有先進性且實用性強，廣泛應用 于PAP的定量分析的方法主要是放射免疫分析巧IA)和酶聯免疫吸附分析巧LISA)，其中 RIA必須用1251等放射性元素標記，檢測設備復雜昂貴，必須用專口的儀器測定，其放射性 核素的半衰期短，不能長期保存，測定結果不穩定，同時也給操作人員帶來了放射性傷害。 ELISA檢測靈敏度不夠高，檢測范圍窄，影響因素較多，易造成假陰性和假陽性等缺點也不 能滿足臨床的要求。化學發光免疫分析方法（CLIA)應運而生。 化學發光分析超微量物質，尤其是臨床分析微量的活性物質始于20世紀70年代，隨后 在臨床上的應用進入一個飛速發展時期。化學發光免疫分析方法（CLIA)靈敏度高，可W達 至IJ10-18mol/L;快速，發光信號在幾秒鐘內產生；操作簡便，測試過程中不使用有害試劑。 本發明是在酶聯免疫分析的基礎上應用酶催化發光底物，通過檢測發光底物產生的光 信號代替酶聯免疫分析中的顯色底物，其靈敏度得到大大提高。本發明所述方法操作簡便， 適用性廣，可實現大批量快檢測，使用成本低，更易在臨床診斷和科研工作推廣應用。
【發明內容】
[0003] 本發明的目的是提供一種熱休克蛋白90(HSP90)化學發光檢測試劑盒及其制備 方法。
[0004] 為達到上述目的，本發明采用如下方案：
[0005] 根據本發明的熱休克蛋白90(服P90)化學發光檢測試劑盒包括W下組分：
[0006] ①熱休克蛋白90WSP90))標準品，所述熱休克蛋白90簡稱服P90;
[0007] ②包被有熱休克蛋白90 (服P90)單克隆抗體的磁顆粒；
[0008] ③酶標記的熱休克蛋白90 (服P90)單克隆抗體；
[0009] ④上述酶作用的化學發光底物A和B;
[0010] ⑥洗涂液；
[0011] ⑧白色不透明微孔板。
[0012] 其中，所述包被有服P90單克隆抗體的磁顆粒經過W下步驟制備：
[0013] ①取5. 0ml磁顆粒質量含量為2. 5%的磁顆粒懸浮液，磁板分離棄上清，用去離子 水洗磁顆粒；所述磁顆粒懸浮液中的液體是濃度為0. 05mol/l、抑值為7. 4的憐酸鹽緩沖 液；
[0014] ②用0. 05mol/L抑值為6.5的憐酸鹽緩沖液洗磁顆粒；
[0015] ③將0. 05mol/L抑值為6.5的憐酸鹽緩沖液與步驟②獲得的磁顆粒混合使總體 積為5. 0~10. 0ml ;
[0016] ④加入5. Omg服P90單抗，于搖床上勻化5~10分鐘；
[0017] ⑥加入5. 0~10.Omg碳二亞胺，于搖床上勻化5~10小時；
[001引⑧用0.Imol/L抑值為7. 4的憐酸鹽緩沖液洗涂2次；
[0019] ⑦加入Tris-EDTA緩沖液，調整總體積至5. 0ml，調抑為7. 5, 2~4°C保存。
[0020] 所述辣根過氧化物酶標記的服P90單克隆抗體是用下述方法制備：
[0021] ①取1.Omg服P90單克隆抗體，加入0. 5~1. 0ml濃度為0. 05mol/L，抑值為7. 5 的憐酸鹽緩沖液溶解，2~4°C保存；
[002引②取5. Omg的辣根過氧化物酶，加入0. 5ml去離子水，溶解后取出0. 06~0. 12ml，加入0. 1ml濃度為0.Imol/L的化104溶液，室溫下避光反應0.5~1.5小時；
[0023] ③將步驟①與②獲得的液體混合，室溫下避光反應4~6小時；
[0024] ④向步驟③獲得的溶液中加入0. 1ml濃度為5mg/mlNaBH4溶液室溫下避光反應 1~2小時；
[002引⑥用0. 02mol/L，抑值為7. 4的憐酸鹽緩沖液透析12~24小時，再用HPLC進行 二次純化，收集蛋白峰，加入等體積的甘油后于-20°C下冷凍保存。
[0026] 3所述洗涂液是用下述方法制備： 取6.05gS徑甲基氨基甲燒、8. 55g化C1、0. 5mlTween-20,加去離子水1000ml，溶解后 用肥1調抑至7. 5。
[0027] 4.所述化學發光底物工作液是用下述方法制備的：
[0028] 所述化學發光底物A液：
[0029] ①配制0. 05mol/LpH值為 8. OTris-Hcl緩沖液；
[0030] ②將3~4mmol魯米諾加入到1000ml步驟①所述的緩沖液中，混勻，2~4°C避光 保存。
[0031] 所述化學發光底物B液：
[0032] ①配制0. 05mol/L抑值為8.OTris-Hcl緩沖液；
[0033] ②將0. 5~0. 7mmo1四苯棚鋼、1. 42mmo1鐵氯化鐘、0. 38mmol肉桂酸、7. 56mmol過 氧化氨加入到1000ml步驟①所述的緩沖液中，混勻，2~4°C保存。
[0034] 使用方法：使用前將A液與B液按1:1比例混合后使用。
[0035] 本發明的優點：
[0036] 本發明試劑盒可W檢測病人血清中HSP90的含量，對于非小細胞肺癌及其它腫瘤 的檢測具有重要的指導意義，與傳統的化ISA方法相比，本發明的試劑盒靈敏度度高，特異 性強，安全可靠。
【附圖說明】
[0037] 圖1服P90試劑盒（實施例1)標準曲線。
【具體實施方式】
[0038] 下面結合具體實施例對本發明做進一步說明。
[0039] 實施例1
[0040] 一種熱休克蛋白90(服P90)化學發光檢測試劑盒，包括W下組份：
[0041] ①熱休克蛋白90WSP90))標準品，所述熱休克蛋白90簡稱服P90 ;
[0042] ②包被有熱休克蛋白90 (服P90)單克隆抗體的磁顆粒；
[0043] ③酶標記的熱休克蛋白90 (服P90)單克隆抗體；
[0044] ④上述酶作用的化學發光底物；
[004引⑥洗涂液；
[0046] ⑧白色不透明微孔板。
[0047] 其中，所述包被有服P90單克隆抗體的磁顆粒經過W下步驟制備：
[0048] ①取5. 0ml磁顆粒質量含量為2. 5%的磁顆粒懸浮液，磁板分離棄上清，用去離子 水洗磁顆粒；所述磁顆粒懸浮液中的液體是濃度為0. 05mol/l、抑值為7. 4的憐酸鹽緩沖 液；
[0049] ②用0. 05mol/L抑值為6.5的憐酸鹽緩沖液洗磁顆粒1次；
[0050] ③將0. 05mol/L抑值為6. 5的憐酸鹽緩沖液與步驟②獲得的磁顆粒混合使總體 積為5. 0ml;
[0051] ④加入5.Omg服P90單抗，于搖床上勻化5分鐘；
[005引⑥加入5. 0~10.Omg碳二亞胺，于搖床上勻化5小時；
[005引⑧用0.Imol/L抑值為7. 4的憐酸鹽緩沖液洗涂2次；
[0054] ⑦加入Tris-EDTA緩沖液，調整總體積至5. 0ml，調抑為7. 5, 2~4°C保