一種米酵菌酸的液相色譜-串聯質譜檢測方法
【技術領域】
[0001] 本發明設及米酵菌酸的液相色譜-串聯質譜檢測方法，屬于儀器檢測技術領域。
【背景技術】
[0002] 米酵菌酸度ongkrekicacid，RA)是挪毒假單胞菌產生的一種毒素，食入該毒素污 染的食物可引起人或動物中毒，重者可致死亡。20世紀30年代研究人員從引起人中毒的挪 子發酵食品樣品中提取出該毒素，并對該毒素的理化性質和致毒機制進行了大量研究，近 年來米酵菌酸又作為研究抗腫瘤疾病和細胞調亡的一種工具試劑來使用。我國70年代從 酵米面中毒樣品中分離出一種稱為"酵米面黃桿菌"（Flawbacwteriumfarinofennentans nosp)的食物中毒菌，其產生的外毒素-酵米面黃桿菌毒素A(簡稱黃桿菌毒素A, flavotoxinA)現證明即為米酵菌酸。
[0003] 米酵菌酸是挪毒假單胞菌產生的一種毒素，食用被其污染的酵米面和變質鮮銀 耳常引起中毒，其分子式〔2化8〇7,分子量486. 61，化學名為3-簇甲基-17-甲氧基-6、18、 21-Ξ甲基二十二碳-2、4、8、12、14、18、20-屯締二酸。對人動物和多種真菌有毒，對熱穩 定，因而熟食也可中毒，而對酸性條件、氧化劑和日光不穩定。
[0004] 米酵菌酸作為酵米面中毒和銀耳中毒的病原菌產牛的毒素之一，具有很強的生物 活性，是挪毒假單胞前引起食物中毒和死亡的主要毒性代謝產物。臨床癥狀表現為惡屯、嘔 吐、腹痛腹脹等，重者出現黃痘、腹水、皮下出血、驚厥、抽搖、血尿、血便等肝腦腎實質性器 官損害癥狀。動物實驗亦表明，米酵菌酸主要作用于肝、腦和腎等實質性臟器且W細胞內的 線粒體最為敏感。 陽0化]米酵菌酸的毒性最早認為是干擾糖代謝，W后人們一直研究其機制。1959年Welling等通過動物試驗發現米酵菌酸可抑制丙酬酸、α -酬戊二酸和蘋果酸的氧化，對憐 酸化過程的抑制更為明顯。1970年化ndersonW大鼠線粒體為材料證明了對氧化憐酸化的 抑制部位不在呼吸鏈，而是線粒體膜上的ADP轉運過程。Weldemamt發現米酵菌酸增加ADP 與線粒體內膜的親合力，阻斷ADP轉運。La叫uin則證明米酵菌酸在線粒體內膜上與ADP載 體形成復合物。于是吳洪娟認為由于米酵菌酸與腺嚷嶺載體ANT(電壓依賴性陰離子通道） 的結合，成為ANT的特異性非競爭性抑制劑，阻礙了ADP與ATP在線粒體內膜的交換，使ATP 生成減少或消失；由于缺乏ATP，細胞膜上的離子累不能發揮正常功能而效率低下，引起細 胞內水鋼滯留，細胞水腫；線粒體內膜依賴ATT'的機制停止工作，造成水鋼滯留，從而引起 線粒體腫脹，崎變短、模糊直至消失。作為細胞內進行呼吸作用和能量交換的重要場所及細 胞內主要的供能器官--線粒體，它的功能消失必將導致細胞、機體的死亡。
【發明內容】
[0006]本發明所要解決的技術問題是：提供一種操作簡便、定性定量能力較強的米酵 菌酸的液相色譜-串聯質譜檢測方法，根據米酵菌酸的肉酸性特性，本發明采用弱陰離子 交換柱，吸附劑上修復的是強堿性基團，保留弱酸性物質粒徑33μπι，孔徑85μπι，表面積 800m2/g，離子容量 0. 60meq/g。
[0007] 為解決上述技術問題，本發明采用的技術方案是：
[0008] 本發明提供的米酵菌酸的液相色譜-串聯質譜檢測方法，包括下列步驟：
[0009] (1)樣品前處理
[0010] 準確稱取經過粉碎、均質過的待檢測樣品2.Og，加入20血甲醇溶液均質提取米酵 菌酸，再加入0. 5g氯化鋼；W上樣品密閉避光振蕩比，再超聲10min，4000;r/min離屯、3min， 取上清液。
[0011] 似富集和凈化 陽01引首先W1血甲醇和1血超純水活化弱陰離子交換柱，活化過程流速控制在1-2滴 /秒，取2mL上清液過弱陰離子交換柱進行富集，流速控制在1滴/秒，接著再W25mM乙酸 錠（P冊-7)溶液和甲醇各ImL淋洗弱陰離子交換柱，W去除雜質，最后WImL5%甲酸甲醇 溶液洗脫米酵菌酸，待液相色譜-串聯質譜化C-MS/M巧檢測。 陽01引 做LC-MS/MS檢測
[0014] 液相條件PhenomenexC18 色譜柱（3.OmmX150mm，5μm)，柱溫 30°C;進樣量 ΙΟμΙ;流動相A為水（含有0. 1%甲酸，5mmol/L甲酸錠），B為95%乙臘（含有0. 1%甲 酸，5mmol/L甲酸錠）；梯度洗脫條件見表1 :
[0015] 表1梯度洗脫條件
[0016]
[0017] 質譜條件離子化方式為電噴霧離子化負模式巧SI-);多反應監測模式(MRM);碰 撞氣壓力（CAD) :6巧簾氣壓力（CUR) :10 ;電噴霧電壓（I巧：-4500V;離子源溫度燈EM): 600 °C。
[0018] 化合物的多反應監測離子對及質譜相關參數如表2所示。
[0019] 表2化合物的多反應監測離子對及質譜相關參數表
[0020]
[0021] *為定量離子
[0022] 液相色譜-質譜檢測時，由于基質效應的影響，導致目標化合物發生離子增強或 抑制作用，采用不含目標待測物得基質空白溶液配制梯度混合標準品溶液（0,10. 〇,20. 0， 50. 0,100. 0,200. 0μg/kg)。按照上述分析條件測定，W峰面積對濃度線性回歸。超出線性 范圍的樣品需要稀釋后重新測定。標準曲線見圖6、7。
[0023] 表4標準曲線及線性關系
[0024]
[0025] 試樣中米酵菌酸色譜峰的保留時間與相應標準色譜峰的保留時間相比較，變化范 圍應在±2. 5%之內。米酵菌酸的定性離子的重構離子色譜峰的信噪比應大于等于3(S/ N> 3)，定量離子的重構離子色譜峰的信噪比應大于等于10 (S/N> 10)，米酵菌酸的檢測低 限為 50μg/kg。
[00%] 本發明的方法操作簡便、定性定量能力較強，可作為檢測銀耳食品質量和評估食 品安全風險的可靠方法。在質譜MRM參數上，本方法采用米酵菌酸帶單電荷的[M-田485.0 分子離子作為母離子。
【附圖說明】
[0027] 下面結合附圖對本發明的【具體實施方式】作進一步詳細的說明。
[0028] 圖1為米酵菌酸的[M-田母離子質譜圖。
[0029] 圖2為米酵菌酸W[M-田離子作為母離子情況下，確定兩對離子對，485. 0/397. 1 和 485. 0/441. 4。
[0030] 圖3為米酵菌酸標準品總離子流圖。
[0031] 圖4離子對485. 0/441. 4的標準曲線。
[0032] 圖5離子對485. 0/397. 1的標準曲線。
【具體實施方式】
[0033] 實施例1母離子的選擇
[0034] 本發明的米酵菌酸質譜檢測方法采用[M-田離子作為母離子，結果表明米酵菌酸 的[M-田離子作為母離子可W得到響應很強的二級離子碎片，其質譜檢測靈敏度明顯高于 現有檢測方法。
[0035] 實施例2樣品前處理條件
[0036] 樣品前處理
[0037] 本實施例是W銀耳樣品為基礎。
[0038] 準確稱取經過粉碎、均質過的銀耳樣品2.Og，加入甲醇溶液均質提取米酵菌 酸，再加入0. 5g氯化鋼；W上樣品密閉避光振蕩比，再超聲10min，4000;r/min離屯、3min，取 上清液待用。
[0039] 富集和凈化 W40] 首先WImL甲醇和ImL超純水活化弱陰離子交換柱，活化過程流速控制在1-2滴 /秒，取2mL上清液過弱陰離子交換柱