一種人免疫球蛋白制品中Tau蛋白抗體含量的檢測方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及生物醫藥檢測技術領域，具體而言，涉及一種人免疫球蛋白制品中Tau 蛋白抗體含量的檢測方法。
【背景技術】
[0002] Tau蛋白是與阿爾茲海默癥相關的一種重要蛋白。人靜脈注射免疫球蛋白 (intravenousimmunoglobulin，IVIG)是臨床用于一種治療免疫缺陷的藥物，含多種抗體。 同時，有研究者發現靜脈注射人免疫球蛋白制品能夠治療阿爾茲海默癥，其作用機理可能 與免疫球蛋白中含有的Tau蛋白抗體有關。
[0003] IVIG若用于阿爾茲海默癥的治療，其中的Tau蛋白抗體含量的多少將是與其治療 阿爾茲海默癥效果相關的重要指標，因此，有必要對IVIG中Tau蛋白抗體含量進行檢測。
[0004] 由于IVIG是以數千人份混合血漿為原料制備的血漿蛋白制品，因此其具有非常 豐富的抗體多樣性，包含成千上萬種蛋白、多肽、核酸甚至小分子物質的IgG抗體，能夠與 多種成分發生抗原抗體反應，而單一一種抗體的含量也較少。常規的酶聯免疫吸附實驗中 用到的封閉液、稀釋液中，常含有各種復雜成分，會與待測樣品發生交叉反應而影響檢測方 法的準確性；同時，因免疫球蛋白中的Tau蛋白抗體含量較低而不易檢測，也會對檢測方法 的準確性產生影響。
【發明內容】
[0005] 為了解決上述問題，本發明的目的在于提供一種人免疫球蛋白制品中Tau蛋白抗 體含量的檢測方法，以提高檢測方法的準確性。
[0006] 本發明所采用的技術方案為：
[0007] -種人免疫球蛋白制品中Tau蛋白抗體含量的檢測方法，包括以下步驟：
[0008] A.抗原包被：在酶標板的每孔中加入Tau蛋白溶液，經孵育操作后用洗滌液洗 滌；
[0009] B.封閉：在所述酶標板的每孔中加入無蛋白封閉液，經孵育操作后用洗滌液洗 滌；
[0010] C. -抗孵育：在所述酶標板的每孔中加入待測樣品，經孵育操作后用洗滌液洗 滌；所述待測樣品為用稀釋液稀釋的人免疫球蛋白制品，所述稀釋液為采用去免疫球蛋白 G的牛血清白蛋白和磷酸鈉-吐溫緩沖液配制的混合液，所述稀釋液中的去免疫球蛋白G的 牛血清白蛋白的質量含量為0.5% -1.5% ;
[0011] D.二抗孵育：在所述酶標板的每孔中加入生物素偶聯的抗一抗的抗體，經孵育操 作后用洗滌液洗滌；
[0012] E.酶標三抗孵育：在所述酶標板的每孔中加入標記酶偶聯的鏈抗生物素蛋白，經 孵育操作后用含有NaCl和Tween-20的Tris-HCl緩沖液洗滌；
[0013] F.吸光度檢測及含量計算：在所述酶標板的每孔中加入顯色底物進行顯色反應， 經孵育操作后再加入終止液終止反應，然后將所述酶標板放入檢測裝置中進行吸光度檢 測，得待測樣品的吸光度值〇D#aWnan，并采用標準曲線法計算出待測樣品中的Tau蛋白抗體 的含量。
[0014] 上述檢測方法中，通過采用無蛋白封閉液而避免了因封閉液中的蛋白質與待測樣 品中的多元抗體發生非特異性結合而影響檢測結果；同時，采用去免疫球蛋白G的牛血清 白蛋白和磷酸鈉-吐溫緩沖液配制的混合液作為稀釋液，避免了因稀釋液中的牛血清白蛋 白中殘留的IgG分子與檢測體系發生交叉反應而影響檢測結果，因此，提高了檢測方法的 準確度。
[0015] 同時，為了避免因待測樣品中Tau蛋白抗體的含量較少而不易測量的問題，上述 檢測方法中，通過步驟C、步驟D和步驟E，使得吸附于酶標板上的Tau蛋白首先與步驟C中 作為一抗的待測樣品中的Tau蛋白抗體發生特異性結合形成一抗復合物，即抗原抗體復合 物。然后該一抗復合物又與步驟D中作為二抗的生物素偶聯的抗體特異性結合形成二抗復 合物；最后該二抗復合與步驟E中作為三抗的標記酶偶聯的鏈抗生物素蛋白特異性結合形 成標記酶偶聯的三抗復合物，通過步驟D和步驟E的生物素放大系統對待測樣品中的Tau 蛋白抗體的檢測信號進行了放大而使其與顯示底物反應后易于被檢測，提高了該檢測方法 的準確性。
[0016] 再者，上述步驟A、B、C、D和E均具有洗滌操作，這樣可以及時洗去各步驟中酶標 板上的游離成分和其他雜質蛋白，以免其影響檢測結果的準確性。
[0017] 因此，該檢測方法能夠更準確地測定人免疫球蛋白制品中Tau蛋白抗體含量。
[0018] 其中，優選地，所述稀釋液中的去免疫球蛋白G的牛血清白蛋白的質量含量為1%
[0019] 進一步，所述生物素偶聯的抗一抗的抗體為生物素偶聯的免疫球蛋白G的Fc片段 的抗體，所述生物素偶聯的免疫球蛋白G的Fc片段的抗體為來源于其他物種的針對于人免 疫球蛋白G的Fc片段的抗體與生物素偶聯后形成的抗體。
[0020] 上述生物素偶聯的人免疫球蛋白G的Fc片段的抗體專門針對于人免疫球蛋白G 中的Fc片段而發生特異性反應，使其更加專一地與結合了Tau蛋白抗體的人免疫球蛋白G 結合，從而可以有效地避免其與測定體系中其它雜蛋白發生反應而影響檢測的準確性，更 好地提高了該檢測方法的準確性。
[0021] 進一步，所述生物素偶聯的免疫球蛋白G的Fc片段的抗體為生物素偶聯的羊抗人 免疫球蛋白G的Fc片段的抗體、生物素偶聯的兔抗人免疫球蛋白G的Fc片段抗體或者生 物素偶聯的鼠抗人免疫球蛋白G的Fc片段抗體。
[0022] 進一步，所述Tau蛋白溶液的濃度為5-20μg/ml;所述洗滌液為磷酸鹽緩沖液； 所述Tris-HCl緩沖液的濃度為0· 01-0. 02mol/L，其含有的NaCl的濃度為0· 1-0. 2mol/L， Tween-20的質量百分含量為0· 05% -0· 2%。
[0023] 優選地，所述Tau蛋白溶液的濃度為15μg/ml;所述所述Tris-HCl緩沖液的濃度 為0· 015mol/L，其含有的NaCl的濃度為0· 15mol/L，Tween-20的質量百分含量為0· 1%。
[0024] 進一步，所述標記酶為堿性磷酸酶，所述顯色底物為對硝基苯磷酸二鈉，所述終止 液為強堿溶液，所述吸光度檢測是檢測酶標板在波長405nm的吸光度值；或者所述標記酶 為辣根過氧化物酶，所述顯色底物為雙氧水與四甲基聯苯胺或者雙氧水與鄰笨二胺，所述 終止液為強酸溶液，所述吸光度檢測是檢測酶標板在波長450nm或492nm的吸光度值。
[0025] 顯色底物為雙氧水與四甲基聯苯胺時，吸光度檢測的波長為450nm;顯色底物為 雙氧水與鄰笨二胺時，吸光度檢測的波長為492nm。
[0026] 進一步，所述洗滌液和所述Tris-HCl緩沖液的洗滌次數均分別為3-5次。
[0027] 上述洗滌次數分別為3-5次，以充分洗去各步驟中的游離成分以及其他殘留的雜 質蛋白。
[0028]進一步，所述孵育操作的孵育溫度為4-37°C，孵育時間為5min-16h。
[0029] 上述檢測方法中，各步驟的孵育操作的溫度可以為4-37Γ，根據孵育溫度，其孵育 時間可以在5min-16h內進行適當調整。溫度高時，孵育時間短些；而溫度低時，孵育時間長 止匕 -、〇
[0030]進一步，所述孵育操作的孵育溫度為25°C，孵育時間為8min-4h。
[0031] 溫度較高時，應縮短孵育時間，以免因孵育時間填充而發生非特異性結合或酶促 反應過度而影響檢測結果。
[0032] 進一步，步驟F中的所述標準曲線法包括以下步驟：
[0033] 溶液配制：將標準品用稀釋液進行梯度稀釋，得到不同濃度的標準品溶液；
[0034] 標準曲線繪制：根據所述檢測方法分別測定所述不同濃度的標準品溶液經檢測反 應后的吸光度值，再以的值對標準品中Tau蛋白濃度值繪制標準曲線并獲得 曲線方程；
[0035] 結果計算：將測得的所述待測樣品的吸光度值0D#aWnan代入曲線方程計算待測樣 品中Tau蛋白抗體含量。
[0036] 其中優選地，標準品溶液的濃度為1. 95ng/ml-500ng/ml之間。
[0037] 進一步，所述標準品為鼠抗人Tau蛋白單克隆抗體，且所述標準曲線繪制中，所用 的生物素偶聯的抗一抗的抗體為生物素偶聯的羊抗鼠免疫球蛋白G的Fc片段的抗體或者 生物素偶聯的兔抗鼠免疫球蛋白G的Fc片段的抗體。
[0038] 容易理解的，根據所選用的作為標準品的Tau蛋白單克隆抗體