檢測異菌脲的酶聯免疫試劑盒及其應用
【技術領域】
[0001] 本發明涉及酶聯免疫檢測技術，具體涉及一種用于檢測異菌脲的酶聯免疫試劑盒 及其應用，可定性、定量檢測煙葉中異菌脲的殘留量。
【背景技術】
[0002] 異菌脲，又名撲海因，分子式為C13H13C12N 303,屬于二甲酰亞胺類，是一種廣譜性觸 殺型保護性殺菌劑，廣泛應用于煙草、果樹、蔬菜的病害防治和水果的貯藏保鮮。異菌脲可 以通過根部吸收起內吸作用，可有效防治對苯并咪唑類內吸殺菌劑有抗性的真菌。其主要 防治對象為由葡萄孢菌、交鏈孢菌、核盤菌等引起的病害，如灰霉病、早疫病、黑斑病、菌核 病等。異菌脲農藥是日本、美國、韓國、澳大利亞、加拿大和食品法典委員會國有限量要求的 檢測項目，其在各類食品中最高殘留限量為〇.〇5~15 mg/kg。目前，異菌脲的檢測方法大多 為液相色譜法和氣相色譜法，所能檢測的基質種類較少，對煙草中異菌脲的檢測方法的相 關專利和文獻報道也較少。
【發明內容】
[0003] 本發明的目的正是基于上述現有技術狀況而提供一種能夠檢測煙草中異菌脲藥 物殘留量的酶聯免疫試劑盒，并提供一種高效、準確、簡便、適于大批量樣品篩選的定性、定 量檢測方法，應用本發明的酶聯免疫法測定煙草中異菌脲的殘留量，具有特異性好、操作簡 單、檢測快速、檢測成本低等優點。
[0004] 本發明的目的是通過以下技術方案來實現的：本發明試劑盒包括：包被有包被原 的酶標板、異菌脲標準品溶液、酶標二抗、異菌脲特異性抗體、底物顯色液、終止液、洗滌液、 復溶液，所述包被原為異菌脲偶聯抗原，所述包被原由異菌脲半抗原與載體蛋白偶聯制備 得到，所述酶標二抗為酶標記的羊抗鼠抗抗體，所述異菌脲半抗原是由2, 6-二氯-4-硝基 苯酚為起始原料，經過與4-溴丁酸叔丁酯的烴基化反應得到羥基2, 6-二氯-4-硝基苯，還 原硝基后，得到烴基2, 6-二氯苯胺，烴基2, 6-二氯苯胺在碳酰氯的作用下，與氨基乙酸縮 合，得到烴基2, 6-二氯苯甘氨酸酯，再經過成環反應，得到異菌脲主體結構化合物，該化合 物再經碳酰氯作用，與異丙胺縮合，得到異菌脲母核結構化合物，在酸性條件下水解反應得 到的。
[0005] 所述載體蛋白可為甲狀腺蛋白、牛血清白蛋白、兔血清蛋白、人血清蛋白、卵清蛋 白、血藍蛋白。
[0006] 所述異菌脲半抗原的分子結構如式I :
[0007] 所述異菌脲特異性抗體是以異菌脲偶聯抗原作為免疫原制備獲得，所述異菌脲特異性 抗體為異菌脲單克隆抗體。
[0008] 所述酶標記的標記酶為辣根過氧化物酶或細菌提取堿性磷酸酯酶，當標記酶為辣 根過氧化物酶時，底物顯色液A液為過氧化氫或過氧化脲，底物顯色液B液為鄰苯二胺或四 甲基聯苯胺，終止液為2 mol/L的硫酸或鹽酸緩沖液；當標記酶為細菌提取堿性磷酸酯酶 時，底物顯色液為對硝基磷酸鹽緩沖液，終止液為2 mol/L硫酸。
[0009] 所述洗滌液pH值為L 4,含有(λ 5%~L 0%吐溫-20、(λ 01%。~0· 03%。疊氮化鈉防腐 劑、0. 1~0. 3 mol/L的磷酸鹽緩沖液；其中的百分比為重量體積百分比，單位g/mL。
[0010] 所述復溶液為pH值為7. 0、0· 02 mol/L的磷酸鹽緩沖液。
[0011] 所述異菌脲標準品溶液的濃度分別為〇 Kg/L、0.5 Pg/L、l. 5 Pg/L、4. 5 Pg/L、13.5 Kg/L、40. 5 Kg/L。
[0012] 其中在酶標板制備過程中所用到的包被緩沖液為pH值為9. 6,0. 05 mol/L的碳酸 鹽緩沖液，封閉液為pH值為7. 1~7. 5,含有1%~3% (g/mL)酪蛋白、0. 1~0. 3 mol/L的磷酸鹽 緩沖液，所述百分比為重量體積百分比。
[0013] 本發明中酶標板的制備過程為：用包被緩沖液將包被原稀釋成20 μ g/mL，每孔加 入100 μ L，25°C避光孵育2 h或4°C過夜，傾去孔中液體，用洗滌液洗滌2次，每次30 s，拍 干，然后在每孔中加入150~200 yL封閉液，25°C避光孵育1~2 h，傾去孔內液體拍干，干燥 后用鋁膜真空密封保存。
[0014] 本發明還提供了一種應用上述酶聯免疫試劑盒檢測異菌脲的方法，它包括步驟： (1) 樣品前處理； (2) 用試劑盒進行檢測； (3) 分析檢測結果。
[0015] 本發明檢測異菌脲的酶聯免疫試劑盒檢測原理為：采用間接競爭ELISA方法，在 酶標板微孔條上預包被偶聯抗原，樣本中殘留的異菌脲與微孔條上預包被的偶聯抗原競爭 抗異菌脲的抗體，加入酶標二抗后，用TMB底物顯色，樣本吸光值與其所含異菌脲的含量成 負相關，與標準曲線比較再乘以其對應的稀釋倍數，即可定性或定量檢測出樣品中異菌脲 的殘留量。本發明的試劑盒通過對2, 6-二氯-4-硝基苯酚進行結構改造，合成了帶有四個 碳鏈長度的羧基半抗原，突出了異菌脲本身的分子結構，增強了免疫原性，使得制備得到的 異菌脲單克隆抗體靈敏度高，特異性強，試劑盒對樣品的前處理方法簡單，無需用到有機溶 劑，樣品處理過程環保，能快速檢測大批量樣品；主要試劑以工作液的形式提供，檢驗方法 方便易行，便于攜帶，試劑盒具有特異性高、靈敏度高、精確度高、準確度高、操作簡單、檢測 時間短、檢測成本低等特點適于大批量煙草樣品的定性、定量篩查。
【附圖說明】
[0016] 圖1為異菌脲半抗原合成路線圖； 圖2為試劑盒標準曲線圖。
【具體實施方式】
[0017] 下面結合具體的實施例來進一步闡述本發明。應理解，這些實施例僅用于說明本 發明，而不用來限制本發明的范圍。
[0018] 實施例1試劑盒組分的制備 1、異菌脲半抗原的制備 化合物a的合成：取5.0 g 2, 6-二氯-4-硝基苯酚與3.2 g 4-溴丁酸叔丁酯在丙酮中 攪拌，再向其中加入2.6 g無水碳酸鉀作為催化劑在60°C反應8 h，反應停止后，蒸干溶劑， 再加水與乙酸乙酯萃取，并用無水硫酸鈉干燥，濃縮，過200-300目硅膠柱，層析分離純化， 得到化合物 a 5.23 g，收率 87%。1HNMR(CDC13,300MHZ)S: 7.945 ( 1H, d, J=0.000), 4.144 ( 2H, t, J=7. 500), 7.945 ( 1H, d, J=0.000), 1.973 ( 2H, tt, J=7. 500, J=7. 367)，2.359 (2H, t, J=7. 367)，1.414 ( 3H), 1.414 ( 3H), 1.414 ( 3H，s)。
[0019] 化合物b的合成：向20 mL水中加入3. 1 g鋅粉和1 mL冰乙酸，在90°C反應 30 min，再加入5. 2 g化合物a的乙醇溶液80 mL，在60°C反應4 h，待反應停止，抽濾，蒸 干，向其中加水與二氯甲烷萃取，靜置，用無水硫酸鈉干燥，用體積比為石油醚：乙酸乙酯 =20:1 重結晶，得到化合物 b 4.8 g，收率 91%。1H NMR (CDC13,300MHZ) δ:6·898 (1H, d, J=0.000), 4.039 (2H, t, J=7. 500), 6.898 (1H, d, J=0.000), 1.965 ( 2H, tt, J=7. 500, J=7. 367), 2.361 ( 2H, t, J=7. 367), 1.414 ( 3H), 1.414 ( 3H, s), 1.414 (3H, s)。
[0020] 化合物c的合成：取4. 7 g化合物b用100 mL乙腈溶解，攪拌，向其中加入2. 16 g氨基乙酸，在氮氣保護下，通入碳酰氯，在50°C下反應7 h，停止反應后，再加入50 mL氫氧 化鈉水溶液，震蕩，旋蒸，除去乙腈，加乙酸乙酯溶解，加水洗滌，濃縮，蒸干，過200- 300目 硅膠柱，層析分離，得到化合物c 3.57 g，收率73%。1H NMR (CDC13，300MHZ) δ :7.536 ( 1H, d, J=0.000), 4.037 ( 2H, t, J=7. 500), 7.535 ( 1H, d, J=0.000), 1.968 ( 2H, tt, J=7. 500, J=7. 367), 2.362 ( 2H, t, J=7. 367), 3.751 ( 2H, s), 1.414 (3H, s), 1. 414 ( 3H, s), 1. 414 ( 3H, s)。
[0021] 化合物D的合成：取3. 4 g化合物c，用1,2-二