用于評價化學心臟毒性的免標記方法
【專利說明】
[0001] 待審美國申請的交叉參考
[0002] 本申請涉及共同擁有并轉讓的在2008年11月25日提交的美國臨時申請系列號 61/117838和在2008年11月11日提交的美國臨時申請系列號12/613, 966,標題為"肝細 胞毒性試驗"，現在為美國專利公開號20100129854,但不請求其優先權。此文件的內容以及 本文提到的出版物或專利文件的所有內容都通過參考結合入本文中。本申請要求2012年 11月15日提交的美國專利申請號61/726620的優先權，其全部內容通過引用納入本文。
技術領域
[0003] 本發明涉及免標記的共振波導光柵（RWG)生物傳感器設備和方法，以評估，例如， 心臟生物學或藥物誘導的心臟毒性。
[0004] 背景
[0005] 在人和動物中，藥物誘導的副作用是已知的并且在很大程度上與主要器官如心 臟、肝臟和腎臟的功能障礙相關。潛在的不良藥物影響增加了安全治療應用復雜性水平。 類似于肝毒性，對心臟毒性的評估是藥物發現和藥物開發過程的重要部分。藥物誘導的心 臟毒性是與某些藥物（包括一些用于治療血液和實體惡性腫瘤的化療劑）相關的不良事 件，并且通常導致發病和高死亡率。在過去的十年中，多種生物化學、細胞和組織研究已經 表明藥物誘導的心臟異常與如下因素的活性變化相關，例如，離子通道、肌細胞結構、胞外 基質（ECM)結構和神經體液系統。藥物心臟毒性也可導致與Ca2+相關的蛋白質異常和信號 傳導系統異常。在這些因素中，離子通道活性的變化已經被認為是藥物誘導的心臟毒性的 主要原因。多種重疊的離子流調節心室動作電位持續的持續時間和形態。Na+通過選擇性 鈉通道快速進入引發了心室的去極化。這之后是通過瞬時激活和鉀通道外向失活的快速再 極化，并且隨后是平臺期，主要由鈣離子通過L-型鈣通道進入來確定。在再極化期間，由鈣 通道的失活以及主要由延時整流鉀通道的慢速和快速型組分（rapidcomponent)攜載的凈 向外鉀離子流的增加使帶負電的跨膜電位恢復。內向整流鉀通道也導致再極化。包括Na+/ Κ+_栗的調節因子使胞內離子濃度恢復至初始狀態。
[0006] 對藥物心臟毒性的評價對于新型藥物的安全開發是重要的。在美國，幾乎所有新 藥的批準之前，評價化合物使體表心電圖QT間隔延長的風險以及威脅生命的心律失常的 風險是一項FDA(美國食品和藥品管理局）的規定。QT間隔是心臟電周期中，Q波起始和Τ 波結束之間的時間測量值。通常，QT間隔表示左右心室的電去極化和再極化。延長的QT間 隔是心室快速性心律失常，如尖端扭轉型室性心動過速（TdP)的生物指標，并且是猝死的 風險因素。QT延長最常見與通過hERG(人ether-a-go-go相關基因）鉀離子通道的電流 損失相關，該損失是由于藥物或通道蛋白的質膜表達的抑制偶然導致的離子通道的直接堵 塞。在大多數的情況中，延長QT間隔的藥物優先抑制編碼IKr通道的α-亞基的基因hERG 或延遲整流鉀離子流通道（I(Kr))的快速型組分。
[0007] 公認的體內藥物心臟毒性評價方法是心電圖（ECG)測試。表面ECG提供了關于電 活動的信息，包括心臟內的心房/心室去極化和心室再極化。在ECG中，QT間隔表示心室 去極化（即，跨膜電位的降低）和再極化（即，靜息電位的恢復）。ECG代表心室動作電位 的持續時間并且包括QT間隔，該間隔反映了兩個心室的活化時間。雖然，大多數藥物誘導 的QT延長與hERG的抑制相關，但還沒有決定性地證明hERG通道的抑制導致長QT間隔的 反向關聯。另外，離子栗活性變化和心肌細胞死亡也可能產生心臟毒性。藥物誘導的不利 風險的早期鑒定有益于在分子水平上評價多重離子通道、細胞增殖和細胞死亡。心臟毒性 測試已成為藥物開發的核心部分。
[0008] 存在用于藥物誘導的心臟毒性的體外評價的若干其他技術，包括使用hERG轉染 細胞或分離的心肌細胞的膜片鉗技術、Rb+流出試驗、使用浦肯野（Purkinje)纖維或豚鼠 乳頭肌的微電極試驗，和基于生物阻抗的心肌細胞分析。其中，膜片鉗技術可能是篩選藥物 誘導的心臟毒性的最廣泛使用的工具，其允許監測單一藥物對單一目標離子通道的一次作 用。雖然這種技術證明了高準確性，但是其不允許同時觀察多個離子通道活性，并且不允許 系統性展示藥物心臟毒性，包括細胞死亡和細胞信號傳導中的變化。大多數其他可行技術 與細胞群的平均測量值相關。整合單細胞生物學和心血管細胞群體的表現的免標記的全細 胞試驗方法將會是高度有利的。
【發明內容】
[0009] 本發明提供了高頻率免標記共振波導光柵（RWG)生物傳感器成像系統和方法，用 于測量在存在和不存在化學物質（如藥物分子）的情況中培養的心肌細胞的動態質量再分 布（DMR)和搏動圖。免標記設備和方法使用共振波導光柵生物傳感器的高頻率掃頻波長解 調來檢測培養的心肌細胞的搏動圖。在實施方式中，本發明也提供了評估藥物誘導心臟毒 性的潛力的數據分析方法。
【附圖說明】
[0010] 在實施方式中：
[0011] 圖1顯示了在具有培養的人iPS-衍生的心肌細胞的EPIC? 384孔微板中的共振 波導光柵生物傳感器3x4陣列的偽彩色高分辨共振波長圖像。圖2是顯示在具有培養的人 iPS-衍生的心肌細胞的RWG生物傳感器的各像素處的基底共振波長的分布。
[0012] 圖3A和3B各自顯示由分析緩沖液（即陰性對照（圖3A))和160nM異丙腎上腺 素（圖3B)誘導的培養的人iPS-衍生的心肌細胞的動態質量再分布信號。
[0013] 圖4是顯示具有培養的人iPS-衍生的心肌細胞的RWG生物傳感器的平均共振峰。 圖5是在EP丨C_? 384孔微板中RWG生物傳感器的3x4陣列的偽彩色共振光強度圖。
[0014] 圖6從左到右顯示了具有靜息狀態下的培養的人iPS-衍生的心肌細胞的RWG生 物傳感器的0至27秒的時間序列的偽彩色共振光強度圖。圖7顯示培養的人iPS-衍生 的心肌細胞搏動的典型搏動圖和關鍵參數，包括：上升時間、松弛時間，和定義搏動圖的強 度％或搏動強度。
[0015] 圖8提供了一系列示例圖（A至F)，其顯示培養的人iPS-衍生的心肌細胞在接觸 前（基線；左列）的搏動圖和在接觸或用特定藥物分子刺激之后隨時間的測量結果（參見 搏動強度％對比時間插圖）中的時間依賴性變化。圖9提供了顯示不同劑量的西沙必利 (cisapride)對培養的心肌細胞搏動的作用的系列圖（a到1):刺激前的心肌細胞的搏動； 和在用不同劑量的西沙必利處理后15分鐘時相應的心肌細胞的搏動。
[0016] 圖10A和10B顯示了伊莎帕定（israpadine)誘導的培養的心肌細胞的搏動率的 時間和劑量依賴的變化圖。顯示了兩個獨立重復實驗的結果（左和右）。
[0017] 圖11A和11B顯示伊莎帕定誘導的培養的心肌細胞的搏動強度的時間和劑量依賴 的變化圖。顯示了兩個獨立重復實驗的結果（左和右）。
[0018] 詳細描述
[0019] 下面參考附圖（如果有的話）詳細描述本發明的各種實施方式。參考各種實施方 式不限制本發明的范圍，本發明范圍僅受所附權利要求書的范圍限制。此外，在本說明書中 列出的任何實施例都不是限制性的，且僅列出要求保護的本發明的諸多可能的實施方式中 的一些實施方式。
[0020] 在一些實施方式中，所揭示的設備以及制造和使用方法提供了一個或多個優勢特 征或方面，包括例如，如下文所述。在任何權利要求中列出的特征或方面通常可應用于本發 明的所有方面。在任一項權利要求中所述的任何單個或多個特征或方面可以結合或與任一 項或多項其它權利要求中所述的任何其它特征或方面置換。
[0021] 定義
[0022] "中心共振波長"是指提供照射光進入波導光柵生物傳感器的最大耦合效率的波 長。
[0023] "包括"、"包含"或類似術語意為包括但不限于，即內含而非排它。
[0024] 在描述本發明實施方式時用來修飾例如組合物中成分的量、濃度、結構尺寸、體 積、處理溫度、處理時間、產率、流速、壓力、粘度等數值及它們的范圍的"約"指的是數量的 變化，可發生在例如：制備化合物、組合物、復合物、濃縮物或應用制劑的典型測定和處理步 驟中；這些步驟中的無意誤差；制造、來源或用來實施所述方法的原料或成分的純度方面 的差異中；以及類似考慮因素中。術語"約"還包括由于組合物或制劑的老化而與特定的初 始濃度或混合物不同的量，以及由于混合或加工組合物或制劑而與特定的初始濃度或混合 物不同的量。
[0025] 除非另外說明，否則，本文所用的不定冠詞"一個"或"一種"及其相應的定冠詞 "該"表示至少一（個/種），或者一（個/種）或多（個/種）。
[0026] 可采用本領域普通技術人員熟知的縮寫（例如，表示小時的"h"或"hr"，表示克的 "g"或"gm"，表示毫升的"mL"，表示室溫的"rt"，表示納米的"nm"以及類似縮寫）。
[0027] 結構、組分、成分、添加劑和類似方面的公開的具體和優選數值及其范圍僅用于說 明，它們不排除其它定義的數值或所定義的范圍內的其它數值。本發明的方法可包括任何 數值或數值、具體數值、更具體的數值和優選數值的任何組合，包括中間值和范圍。
[0028] 細胞的體外培養提供了可用于藥理學、生理學和毒理學研究的材料。藥物篩選技 術中的近期進展使藥物公司能針對治療靶標快速篩選龐大的化合物庫。
[0029] 心臟毒性是可能導致心肌損傷的情況。藥物誘導的心臟毒性是指通過藥物影響心 臟的心臟毒性，并且包括藥物對心臟的直接作用，但也可包括間接作用，例如，由于血液動 力流變化的增強或由于血栓事件。嚴重的心臟毒性可導致心肌病。心肌病常因治療（如化 療治療法）所致，或者可以是由一組可造成損傷的心肌的疾病或病癥導致。心肌損傷可造 成心臟栗送作用紊亂，并隨后導致心力衰竭。
[0030] 藥物誘導的心臟毒性通常導致左心室功能障礙、節律紊亂和缺血。這些毒性作用 可從亞臨床異常到威脅生命的狀態。這些作用可能與藥物接觸或醫療相關，但也可能與長 期心血管作用相關。通常可能會導致心臟毒性或心肌病的藥療法包括，例如，蒽環類藥物。 包括多柔比星在內的蒽環類藥物可用于治療白血病、淋巴瘤、多發性骨髓瘤、乳腺癌、肉瘤 和其他癌癥。多柔比星相關的心臟毒性（AAC)已被長期公認，并且可分成三種形式：即期心 包炎-心肌炎綜合征、早發慢性進行性形式和晚發慢性進行性形式。AAC的潛在機制的主要 假設是反應性自由基物質的生成，所述物質與細胞膜相互作用并破壞細胞膜。其他可能的 機制包括，例如，誘導凋亡、線粒體DNA破壞、ATP生成的變化和肌漿網鈣ATP酶的mRNA表 達下調。
[0031] 在過去的數十年中，新藥的開發已經揭示了藥物，尤其是抗癌藥的致心律失常作 用新譜，